光合細菌的分離、培養(yǎng)和鑒定

光合細菌的分離、培養(yǎng)和鑒定摘要：從南灣水庫大壩下層水域取水樣獲得一株光合細菌。采用多種培養(yǎng)基分離方法分離出純培養(yǎng)物。進行了菌落形態(tài)學觀察和亞顯微觀察。于不同條件下培養(yǎng)后分別測定光密度和生長曲線。實驗證實分離到的菌種為沼澤紅假單胞菌。關(guān)鍵詞：生長曲線；沼澤紅假單胞菌；光合細菌TheseparationandcultureandidentifiedofphotosyntheticbacteriaAbstract:AstrainsampleofphotosyntheticbacteriawasgotfromthelowerwaterinSouthBayReservoir.usingavarietyofseparationmethodstogetpurecultures.Itwasculturedwithvariousmediumtoculturethepurestrains.Transmissionelectionmicrographsandmicroscopewereobservedofthestrain.Theopticaldensity(OD)andthegrowthcurveweremeasuredunderdifferentconditions.TheresultssuggestedthatthestrainwasRhodopseudomonaspalustris.Keywords:Colonyandcell;Growthcurve;Rhodopseudomonaspalustris;Photosyntheticbacteria引言光合細菌由于碳、氮代謝途徑和光合作用機制的獨特性和其生理類群的多樣性,而被大量關(guān)注。多年來,光合細菌一直被作為研究光合作用以及生物固氮作用機理的重要材料。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)光合細菌在環(huán)保、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等方面均有較高的應(yīng)用價值。下面就光合細菌目前的開發(fā)應(yīng)用研究近況作一概述。光合細菌細胞營養(yǎng)價值極高。首先，光合細菌細胞干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量高達60%以上,比目前生產(chǎn)的單細胞蛋白酵母中蛋白質(zhì)的含量還高。而且其蛋白質(zhì)氨基酸組成齊全,是一種優(yōu)質(zhì)蛋白源。其次，光合細菌細胞含有多種維生素,特別是B族維生素，VB12、葉酸、泛酸、生物素的含量遠遠高于酵母菌。另外，光合細菌細胞還含有大量的類胡蘿卜素、輔酶Q等活性物質(zhì)。因此,光合細菌具有很高的營養(yǎng)價值。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，光合細菌可被用于餌料或飼料添加劑。光合細菌促進魚蝦的生長，無論是成活率或是產(chǎn)量的提高均可達10%-40%以上。同時，光合細菌還具有防治魚蝦疾病，凈化養(yǎng)殖場所水質(zhì)等方面的功能。使用光合細菌喂養(yǎng)的家禽，成活率可提高5%-7%，料肉比降低33%左右，肉雞增重15%-17%，產(chǎn)蛋率提高12.7%。而且所產(chǎn)蛋的蛋黃顏色明顯亮澤發(fā)紅，這是因為卵黃中維生素C、類胡蘿卜素含量提高20%左右。現(xiàn)在人們都大力提倡使用有機肥料和“生物農(nóng)藥”。而光合細菌已被證明不但是一種優(yōu)質(zhì)的有機肥料同時可以增強植物的抗病能力。光合細菌可作為底肥、或以葉面噴施、拌種等方式應(yīng)用到作物。利用光合細菌處理有機廢水，在國外已得到初步應(yīng)用。小林正泰等在日本自六十年代起，首先開展了用使PSB處理有機廢水的試驗研究，先后成功地用光合細菌對糞尿、淀粉、食品、皮革、豆制品等廢水進行處理，建并立了一批日處理幾十噸、幾百噸至幾千噸高濃度有機廢水的大中型凈水系統(tǒng)，運行多年證實效果良好。近年來，美國、澳大利亞等也相繼進行了這方面的研究工作。我國對此也進行了一些研究。上海交通大學生物技術(shù)研究所利用光合細菌對豆制品、洗毛、牛糞等廢水進行處理，并在小林正泰的幫助下與南通發(fā)酵廠合作，用PSB法成功地進行日處理150噸檸檬酸廢水的研究，取得了中試成果。吳國慶等使用紅螺菌對12種染料進行了初步脫色實驗，在黑暗厭氧條件下紅螺菌對其中的12種染料具有良好的脫色作用。光合細菌法處理污水主要有以下優(yōu)點:a、除氮效果好，耐鹽能力強;b、不存在污泥的處置問題，處理后的污泥都是很好的有機肥料;c、有機負荷高，光合細菌可直接處理幾千至幾萬COD的高濃度有機廢水，并且無需稀釋;d、投資費用低，占地面積小，消耗動力低，節(jié)省能源；e、便管理，在10-40°C內(nèi)均可處理，受季節(jié)影響小?？偟膩碚f，光合細菌還是一種廢水處理的好方法。光合細菌中如紅螺菌屬(Rhodospirillum)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomon-as)、紅微菌屬(Rhodomicrobium)等屬細菌在新陳代謝過程中都會釋放氫氣。生物制氫是利用微生物代謝過程生產(chǎn)分子氫的一項生物工程技術(shù)，是人們開發(fā)新能源的一個方向。光合細菌利用有機廢水產(chǎn)氫是一個重要的研究開發(fā)內(nèi)容。一方面有機廢水可以為光合細菌提供大量廉價的有機基質(zhì)，尤其是高濃度的有機廢水，其溶解氧極易被好氧或兼性厭氧微生物消耗后造成厭氧環(huán)境，從而有利于光合細菌產(chǎn)氫。另一方面產(chǎn)氫的同時還伴隨有機物的降解和光合細菌菌體的生成，廢水就可以得到凈化。如使用深紅紅螺菌(R.rubrum)分解有機物進行光合產(chǎn)氫，產(chǎn)量高達65mg/L,比藍細菌產(chǎn)氫量高一倍多。目前，我國國內(nèi)有將光合細菌菌劑制成魚蝦寶、雞鴨寶等產(chǎn)品各種。國外公司利用光合細菌制成微生態(tài)制劑，如EM制劑等等。此外光合細菌還被制作為保健食品，經(jīng)動物實驗表明光合細菌具有延緩衰老、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)的顯著功效，這可能與光合細菌細胞中富含類胡蘿卜素和B族維生素及活性物質(zhì)等有關(guān)。光合細菌也是提取天然藥物的良好素材之一。山西大學利用光合細菌提取抗癌藥，中國科學院與山西安泰生物工程公司共同研制了“安泰369口服液”就是利用了光合細菌網(wǎng)，太原康強藥業(yè)有限公司研制的康強膠囊就是光合細菌與中藥組分結(jié)合用于治療糖尿病。此外，1992年，全美保健食品中有6.5%都加有光合細菌，最具代表性的當屬新奧爾良?貝魯斯潘有限公司投產(chǎn)的PGH濃縮液含維生素、微量元素、氨基酸?？烧{(diào)節(jié)內(nèi)分泌提高機體免疫能力，上市后至今暢銷不衰。還有一種叫“米格申”的含光合細菌菌液的飲料可以在健全中樞神經(jīng)、預(yù)防老年癡呆上效果顯著。在日本，光合細菌飲料也因為具有延緩衰老的作用以及在防止心臟病、腦梗塞、癌癥等方面的功效而倍受青睞。因此對光合細菌的研究很有實用價值和現(xiàn)實意義。本實驗通過對本市南灣水庫大壩下層水域和附近魚塘底泥進行采樣，經(jīng)過分離和富集培養(yǎng)得到純的培養(yǎng)物，再對純菌株進行鑒定證實分離出了沼澤紅假單胞菌，是一種非常有利用價值的光合細菌。此實驗對以后進一步研究和開發(fā)利用光合細菌很有意義。采樣和分離、培養(yǎng)的方法樣品的采集2009年10月從信陽市南灣水庫大壩下層水域取水樣及附近魚塘底泥取樣。培養(yǎng)基的配置富集培養(yǎng)基：NH4C10.1g,NaHCO30.2g(5%水溶液，過濾除菌取4ml加入)，K2HPO40.02g,NaCH2CO30.1?0.5g(取0.3g),MgSO4(H2O)70.02g,NaCl0.2g,酵母膏0.1g,蒸餾水96ml,pH7.0。半固體培養(yǎng)基：1％的比例在富集培養(yǎng)基中添加瓊脂。固體培養(yǎng)基：2％的比例在富集培養(yǎng)基中添加瓊脂。將樣品用富集培養(yǎng)基富集分裝至試管，每管加樣品1克后再加滅菌液體石蠟，隔絕氧氣培養(yǎng)。當其培養(yǎng)液變色后,重復(fù)進行富集培養(yǎng)2-3次后進行純化分離:取富集液劃線于固體培養(yǎng)基表面，采用焦性沒食子酸去氧法進行厭氧光照培養(yǎng)重復(fù)2-3次以獲得純培養(yǎng)物。采用雙層平板法，下層平板為2%固體培養(yǎng)基，劃線接種后上層倒1%半固體培養(yǎng)基。下層平板為2%固體培養(yǎng)基，接種后，倒入滅菌的液體石蠟覆蓋3-4毫米。培養(yǎng)條件:28-30°C;白熾燈光照,照度為2000-2500lx；好氧條件，培養(yǎng)時間為7-14d。富集培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)部分試管變紅色，少部分試管變綠色，獲得純培養(yǎng)物后，有紅色菌落和綠色菌落，將菌落移至斜面培養(yǎng)基保存留作研究使用。富集培養(yǎng)將紅色菌落接種于富集培養(yǎng)基中，倒入滅菌的液體石蠟覆蓋3-4毫米。培養(yǎng)條件:28-30°C;白熾燈光照,照度為2000-25001X;微好氧條件，培養(yǎng)時間為7-14d。顯微鏡觀察菌落及菌體形態(tài)學觀察以瓊脂平板上生長的菌落形態(tài)記述;菌體形態(tài)以光學顯微鏡與電子顯微鏡相結(jié)合;用電鏡觀察細菌鞭毛、繁殖方式及光合內(nèi)膜結(jié)構(gòu)類型。電子顯微鏡制片用2.5%戊二醛和2%鋨酸雙重固定，丙酮系列脫水。lxm812包埋，LKB超薄切片機切片，切片經(jīng)醋酸雙氧鈾一檸檬酸鉛雙重染色后，于Hitachi600A2型透射電鏡下觀察并拍照。1.5光合細菌光密度(0D)的測定生長曲線通常，光合細菌數(shù)量的多少可用光密度值來衡量。細菌菌體是不透光的，光束通過細菌懸液將會由于被散射或被吸收而降低其透過率。細菌懸液的濃度同光密度成正比，同透光度成反比，而光密度或透光度可以借光電池精確測出，所以可用光密度來表示細菌相對數(shù)目。不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)光合細菌，將分離到的菌株分別在光照好氧，光照厭氧，黑暗好氧，黑暗厭氧四種條件下培養(yǎng)7-14天，測其在波長663nm處的OD值，記錄并比較其生長曲線。結(jié)果光合細菌菌落和菌體形態(tài)學觀察光合細菌的菌落形態(tài)分離到的光合細菌為二紅色菌株，暫命名為PSB-1、PSB-2.其菌落特征見表2-1表1分離菌株的菌落特征項目細胞形細胞大鞭毛 革蘭液體培增值方式菌落形態(tài)

狀?。╩）氏染色養(yǎng)PSB-1桿狀0.5X單根極生紅二等分裂深紅色，邊緣整齊，1.5中間隆起，表面濕潤，D=1-2mmPSB-2弧狀0.5X單根極生紅二等分裂深紅色，邊緣整齊，1.5中間隆起，表面濕潤D=1-2mmPSB-1的菌體形態(tài)革蘭氏染色結(jié)果見圖2-1圖2-1PSB-1革蘭氏染色（X1000）PSB-1的透射電鏡照片PSB-1的透射電鏡照片見圖2-2

圖2光合細菌的電鏡照片F(xiàn)ig.2Transmissionelectionmicrographs(TEM)ofthecellofthebacteria2.2光合細菌生長曲線不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)光合細菌分離到的菌株分別在光照好氧，光照厭氧，黑暗好氧黑暗厭氧四種條件下培養(yǎng)7-14天，測其在波長663nm處的OD值,記錄并比較其生長曲線。PSB-1,2均在光照厭氧條件下生長最好。見圖2-3PSB-1在不同條件下的生長曲線黑暗有氧■-□---黑暗厭氧光照有氧6 8 10 12 14 16 18 20黑暗有氧■-□---黑暗厭氧光照有氧6 8 10 12 14 16 18 20生長曲線(d)525Z15a光照厭氧圖3.光合細菌生長曲線結(jié)果分析證實了分離到的菌種為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustr)is參考文獻：DugdaleRC,GoeringJJ.Uptakeofnewandregeneratedformsofnitrogeninprimaryproductivity[J].LimnologyandOceanography,1967,15(12):19-26.DugdaleRC.Nutrientlimitationinthesea:dynamics,identificationandsignificance[J].LimnologyandOceanography,1967,23(12):685.BrandesJA,DevolAH.Aglobalmarine2fixednitrogenisotopicbudget:ImplicationsforHolocenenitrogencycling[J].GlobalBilogeochemicalCycles,2002,16(4):202-232.劉雙江，楊惠芳,周培瑾，等.固定化光合細菌處理豆制品廢水產(chǎn)氫研究J],環(huán)境科學，1995,(1):42-44.JoongKyunKim，Bum-KyuLee，Sang-HeeKim，etal.ACharaeterizationofdenitrifyingPhotosyntheticbaeteriaisolatedFromphotosyntheticSludge[J].AquaeulturalEngineering，1999，19(3):179-193.Grotsis-SkretasO，ChristakiV.PhysiologiealresponsesoftwomarinePhytoptanktonicspeeiestoCuandHg.MaPTechRepSer，l992，69(1):151-153.BakerMD,MayfieldCl,InnissWE.ToxieityofPH,heavymetalsandbisulfatetoafreshwate