微生物與免疫學(xué)實驗四酶聯(lián)免疫吸附實驗詳解演示文稿

微生物與免疫學(xué)實驗四酶聯(lián)免疫吸附實驗詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有31頁\編輯于星期三優(yōu)選微生物與免疫學(xué)實驗四酶聯(lián)免疫吸附實驗現(xiàn)在是2頁\一共有31頁\編輯于星期三ELISA簡介1971年瑞典學(xué)者Engvall和Perlmann，荷蘭學(xué)者VanWeeman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）現(xiàn)在是3頁\一共有31頁\編輯于星期三ELISA基本的實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色現(xiàn)在是4頁\一共有31頁\編輯于星期三ELISA檢測抗原

Ag+ Ab*Ag-Ab*現(xiàn)在是5頁\一共有31頁\編輯于星期三ELISA檢測抗體

Ab+ Ag*Ab-Ag*現(xiàn)在是6頁\一共有31頁\編輯于星期三ELISA檢測抗體(間接法)Ag+Ab1Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*Ag-Ab1-Ab2*現(xiàn)在是7頁\一共有31頁\編輯于星期三由于結(jié)合在抗原—抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個分子結(jié)合3～5個分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時又可結(jié)合3—5分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示，這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。間接法比直接法靈敏現(xiàn)在是8頁\一共有31頁\編輯于星期三酶標(biāo)板現(xiàn)在是9頁\一共有31頁\編輯于星期三酶標(biāo)儀現(xiàn)在是10頁\一共有31頁\編輯于星期三一、ELISA法間接法檢測血清中HBsAb【實驗?zāi)康摹?．熟悉ELISA的原理。2．了解免疫標(biāo)記技術(shù)的原理?！緦嶒炘怼?/p>

采用純化HBsAg包被反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本，同時加入HBsAg-HRP。當(dāng)標(biāo)本中存在HBsAb時，就會形成HBsAg-HBsAb-HBsAg-HRP復(fù)合物，加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無顯色反應(yīng)。現(xiàn)在是11頁\一共有31頁\編輯于星期三將抗原HBsAg吸附于載體表面（廠家已經(jīng)完成）現(xiàn)在是12頁\一共有31頁\編輯于星期三將待測血清加入，溫育，血清中如有HBsAb，則抗原抗體結(jié)合現(xiàn)在是13頁\一共有31頁\編輯于星期三加入酶復(fù)合物，(HBsAg-HRP),酶復(fù)合物與表面抗體結(jié)合現(xiàn)在是14頁\一共有31頁\編輯于星期三加入酶的底物，酶與底物反應(yīng)，顯色現(xiàn)在是15頁\一共有31頁\編輯于星期三二、ELISA間接法檢測血清中HBsAg原理同檢測抗體,但小孔底部包被的為HBsAb酶復(fù)合物為:HBsAb-HRP當(dāng)標(biāo)本中存在HBsAg時，就會形成HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP復(fù)合物，加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無顯色反應(yīng)?，F(xiàn)在是16頁\一共有31頁\編輯于星期三【實驗材料】1．乙肝病毒HBsAg（或HBsAb）酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。

預(yù)包被微孔條（用純化的單抗-HBs或純化HBsAg包被）酶結(jié)合物（多克隆抗-HBs-HRP或HBsAg-HRP）陽性對照陰性對照洗滌液(濃縮液，用前以蒸餾水稀釋25倍)顯色劑A、B（一般為四甲基聯(lián)苯胺和H2O2）終止液（2mol/LH2SO4）。2．微量加樣器，吸水紙等?，F(xiàn)在是17頁\一共有31頁\編輯于星期三①檢測HBsAg或HBsAb的反應(yīng)條②酶標(biāo)抗體③陰性對照血清④陽性對照血清⑤洗滌液⑥顯色液(A,B)ELISA試劑盒包含以下各組分：現(xiàn)在是18頁\一共有31頁\編輯于星期三待測血清1號、2號、3號、4號注意：待測血清是從醫(yī)院采集的正常血清(人為加進(jìn)去乙肝表面抗原或者抗體)，但是并不表示血清中不含有可傳染的疾病，所以實驗中要注意安全?，F(xiàn)在是19頁\一共有31頁\編輯于星期三實驗步驟每4人一組，每組有檢測HBsAg和檢測HBsAb的反應(yīng)條各一條,每條含6個反應(yīng)孔。每組有2種試劑盒(黃色測HBsAg,粉紅色測HBsAb),黃色試劑盒用黃色反應(yīng)條,粉紅色試劑盒用紅色反應(yīng)條?，F(xiàn)在是20頁\一共有31頁\編輯于星期三3、檢測方法每孔加待檢血清50ul,每次實驗各做1個陰性對照和陽性對照;本實驗空白對照孔不設(shè)，前面講臺上有空白的反應(yīng)條，可以作為空白對照。注意：每位同學(xué)選擇一種待測血清進(jìn)行檢測（見下圖）?，F(xiàn)在是21頁\一共有31頁\編輯于星期三陰性陽性待檢血清甲,乙,丙………….對照對照1號同學(xué)取待測血清1號…………..陰性陽性待檢血清甲,乙,丙………….對照對照1號同學(xué)取待測血清1號2號同學(xué)取待測血清2號…………..2號同學(xué)取待測血清2號現(xiàn)在是22頁\一共有31頁\編輯于星期三(2)每孔加1滴酶結(jié)合物,充分混勻，37℃孵育30min(3)甩棄孔內(nèi)液體（在水池中甩棄，不要在實驗室中隨地甩棄）；(4)每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩干。同上洗滌重復(fù)5次，拍干?，F(xiàn)在是23頁\一共有31頁\編輯于星期三(6)每孔加顯色液A,B各1滴,充分混勻，置37℃15min.按以下方法,進(jìn)行肉眼觀察結(jié)果:

陰性對照孔無色,陽性對照孔藍(lán)色;

待測孔顯藍(lán)色,為陽性,否則為陰性。(7)加終止液（本實驗不加終止液）現(xiàn)在是24頁\一共有31頁\編輯于星期三4結(jié)果記錄及結(jié)論陰性對照孔陽性對照孔空白對照孔待測1待測2結(jié)果結(jié)論待測3待測4現(xiàn)在是25頁\一共有31頁\編輯于星期三HBV屬于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原體。在中國，HBV感染或攜帶者已超過1.3億，發(fā)病人數(shù)超過3000萬人。HBV基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，其中有一個單鏈區(qū)。HBV的抗原組成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)組成。三種抗原具有其相應(yīng)抗體：HBsAb（抗表面抗原抗體）、HBeAb（抗e抗原抗體）、HBcAb（抗核心抗原抗體）?，F(xiàn)在是26頁\一共有31頁\編輯于星期三HBsAg為二聚體糖蛋白，大量存在于感染者血液中，為HBV感染的主要標(biāo)志；HBcAg存在于Dane顆粒核心結(jié)構(gòu)表面，為內(nèi)殼成分，其外被HBsAg覆蓋，不易在血循環(huán)中檢出，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗-HBc，抗-HBcIgM的存在提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)；HBeAg游離于血中，其消長與病毒體消長及DNA多聚酶消長基本一致，故HBeAg為HBV復(fù)制及具有強(qiáng)感染性的一個指標(biāo)；現(xiàn)在是27頁\一共有31頁\編輯于星期三HBeAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗-HBe能與受染肝細(xì)胞表面的HBeAg結(jié)合，通過補(bǔ)體介導(dǎo)破壞受染肝細(xì)胞，抗-HBe的出現(xiàn)是預(yù)防后良好的象征。HBV的主要感染源是患者或無癥狀的HBsAg攜帶者，通過血液、體液、母嬰傳播。本實驗只檢測HBsAg及其抗體HBsAb現(xiàn)在是28頁\一共有31頁\編輯于星期三HBsAg（本實驗測）HBeAg抗-HBs（本實驗測）抗-HBe抗-HBc結(jié)果分析+----HBV感染或無癥狀攜帶者++---急慢性乙肝或攜帶者++--+“大三陽”急慢性乙肝患者（傳染性強(qiáng)）+--++“小三陽”急慢性乙肝感染，趨向于恢復(fù)--+++既往感染恢復(fù)期----+既往感染或“窗口期”--+--既往感染或接種過疫苗乙肝兩對半檢測的結(jié)果判斷方法現(xiàn)在是29頁\一共有31頁\編輯于星期三【注意事項】1．試劑盒應(yīng)于4℃存放，在有效期內(nèi)使用。2．微孔條須密封防潮，從冷藏環(huán)境中取出時,應(yīng)在室溫中平衡至潮氣盡