備課素材：雜交瘤細胞的抗凋亡-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修三

雜交瘤細胞的抗凋亡先看一道試題：H18雜交瘤細胞在培養(yǎng)過程中的凋亡現(xiàn)象制約著其生產(chǎn)能力的提高。通過基因工程可改造H18雜交瘤細胞的抗凋亡能力，相關(guān)步驟如下:①細胞培養(yǎng)。將人肝癌細胞在含10%小牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一段時間后，用胰蛋白酶處理培養(yǎng)液，漂洗后調(diào)整細胞懸液濃度為1×107個/mL。②免疫小鼠。向小鼠體內(nèi)注射肝癌細胞懸液0.8mL，以后每隔2周免疫1次，共免疫3次，最后1次免疫后3天，取脾臟制成細胞懸液備用。③細胞融合及篩選。將脾臟細胞懸液和骨髓瘤細胞懸液在50%PEG作用下進行融合，篩選出能產(chǎn)生抗人肝癌的單克隆抗體HAb18的H18雜交瘤細胞。④改造H18雜交瘤細胞。利用PCR技術(shù)獲得小鼠的bcl—XL基因(抗凋亡基因)，構(gòu)建表達載體，通過脂質(zhì)體法將其導(dǎo)入H18雜交瘤細胞中，再篩選出抗凋亡能力明顯提高的H18雜交瘤細胞。請分析回答下列問題。（1）步驟①中，肝癌細胞合成培養(yǎng)液中特有的成分是

，培養(yǎng)液中還需加入一定量抗生素的目的是

。（2）步驟②中，肝癌細胞免疫小鼠需在一定時間內(nèi)間隔注射3次，其目的是

。（3）步驟③中，除了用50%PEG促進細胞融合外，常用的生物誘導(dǎo)因素是

，物理誘導(dǎo)方法是

(寫出一種即可)。步驟④中，通過脂質(zhì)體法將表達載體導(dǎo)入H18雜交瘤細胞的過程依賴的原理是

。（4）與普通抗肝癌藥物相比，用抗人肝癌單克隆抗體HAb18與相應(yīng)抗癌藥物結(jié)合制成的“生物導(dǎo)彈”治療肝癌的主要優(yōu)點是

。（5）乙醇有誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。為了建立H18雜交瘤細胞凋亡檢測模型，科研人員利用不同濃度的乙醇溶液誘導(dǎo)H18雜交瘤細胞凋亡，其結(jié)果如圖所示:抗凋亡細胞株的建立與篩選應(yīng)選擇的誘導(dǎo)條件是

(用圖中字母表示)。答案：（1）血清

防止雜菌污染（2）增強免疫，刺激小鼠產(chǎn)生更多的淋巴細胞（3）滅活的病毒

電刺激

膜的流動性（4）能將藥物定向帶到癌細胞所在部位，減少對正常細胞的傷害，減少用藥劑量（5）C解析：（1）步驟①中肝癌細胞合成培養(yǎng)液中特有的成分是血清，目的是補充細胞生長所需的未知營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)液中還需加入一定量抗生素的目的是防止雜菌污染。（2）肝癌細胞免疫小鼠需在一定時間內(nèi)間隔注射3次,其目的是增強免疫，刺激小鼠產(chǎn)生更多的淋巴細胞。（3）步驟③中，除了用50%PEG促進細胞融合外，常用的生物誘導(dǎo)因素是滅活的病毒，物理誘導(dǎo)方法是電刺激。傳統(tǒng)的脂質(zhì)體是將磷脂、膽固醇或其他脂類的乙醚溶液加入DNA溶液中，經(jīng)特殊處理而得到單層或雙層的帶DNA的脂質(zhì)體小泡，其可被受體細胞內(nèi)吞而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。故步驟④中通過脂質(zhì)體法將表達載體導(dǎo)入H18雜交瘤細胞的過程依賴的原理是膜的流動性。（4）與普通抗肝癌藥物相比，用抗人肝癌單克隆抗體HAb18與相應(yīng)抗癌藥物結(jié)合制成的“生物導(dǎo)彈”治療肝癌的主要優(yōu)點是能將藥物定向帶到癌細胞所在部位，減少對正常細胞的傷害，減少用藥劑量。（5）分析柱形圖可知，該實驗的自變量是乙醇誘導(dǎo)的時間及乙醇的濃度，因變量是凋亡細胞的比例；根據(jù)實驗結(jié)果可知，乙醇濃度為510mmol/L誘導(dǎo)6－7h時，細胞凋亡的比例最高。因此抗凋亡細胞株的建立與篩選應(yīng)選擇的誘導(dǎo)條件是濃度為510mmol/L乙醇誘導(dǎo)6h，此時凋亡細胞比例最大且誘導(dǎo)用時較短，故選C項。這道試題涉及到雜交瘤細胞的抗凋亡。教材中沒有提到。那么，如何提高雜交瘤細胞的抗凋亡能力？近年來，利用抗凋亡基因，改造動物細胞，使其具有較強的抗凋亡能力。在動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的生產(chǎn)工藝中已被應(yīng)用。由于動物細胞在生物反應(yīng)器中進行大規(guī)模高密度培養(yǎng)時，細胞的生長易受各種條件的影響而變化，如營養(yǎng)缺乏、代謝產(chǎn)物累積、pH和溶氧、機械攪拌和剪切力等因素都會誘發(fā)細胞凋亡。因此，抗細胞凋亡的研究，對提高動物細胞表達產(chǎn)品的產(chǎn)量具有重要意義。理解上述試題中的實驗步驟，需要了解三個方面的知識，一是H18雜交瘤細胞的獲得；二是增強抗凋亡能力提高的辦法；三是如何篩選抗凋亡能力強的H18雜交瘤細胞。第一、獲得H18雜交瘤細胞。利用參考教材中的雜交瘤細胞的方法。只不過原料細胞是肝癌細胞和脾臟細胞，篩選出“抗人肝癌的單克隆抗體HAb18”。當(dāng)然，首先需要注射人肝癌細胞到小鼠體內(nèi)獲取脾臟細胞懸液（內(nèi)含效應(yīng)B細胞）。第二、增強抗凋亡能力提高。與凋亡相關(guān)的一系列基因產(chǎn)物可對細胞凋亡進行正負向的調(diào)控，因此通過導(dǎo)入相應(yīng)基因可以調(diào)節(jié)細胞凋亡。bcl—XL基因具有抗凋亡能力的基因，原因是Bcl-xL是Bcl-2家族蛋白，在細胞凋亡調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Bcl-xL可以和其它促凋亡蛋白形成異源二聚體而抑制細胞凋亡，也可以直接在線粒體外膜上形成寡聚體通道以在細胞應(yīng)激時維持線粒體膜的正常狀態(tài)。用PEF質(zhì)粒和目的基因bcl—XL基因構(gòu)建重組表達載體，重組前需要對目的基因進行PCR技術(shù)擴增，重組時用PstⅠ和XhoⅠ雙酶切，通過脂質(zhì)體法將其導(dǎo)入H18雜交瘤細胞中。第三、篩選和哀慟抗凋亡能力強和分泌單克隆抗體多的H18雜交瘤細胞。利用藥物G418（遺傳霉素）是一種氨基糖苷類抗生素，在分子遺傳試驗中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。通過G418篩選出穩(wěn)定高表達的bcl—XL的克隆株，利用促抗體分泌添加劑丁酸鈉（NaBu）誘導(dǎo)雜交