血紅素蛋白優(yōu)秀公開課件

第五章血紅素蛋白及催化體系在生物體內(nèi)，除了含鐵蛋白的氧載體之外，還有多種含鐵蛋白，在生物體內(nèi)起著傳遞電子、參與各種酶催化體系以及鐵自身的吸收、儲存、運送等。第一節(jié)細胞色素：電子傳遞在生物體系中，電子傳遞反應是一系列重要生物過程的基本反應，所有的氧化還原反應都會涉及電子的轉(zhuǎn)移。由于鐵、銅等過渡金屬離子有可變的化合價，通過其價態(tài)之間的變化，如Fe(III)/Fe(II)、Cu(II)/Cu(I)等，可以有效地進行電子傳遞。所以在生物體內(nèi)形成了一些含有鐵、銅等過渡金屬離子的蛋白分子作為生物過程中的電子傳遞體。1、鐵硫蛋白，該蛋白活性中心含有非血紅素的鐵硫簇合物；目前已知的電子傳遞蛋白主要有三類：2、活性中心含有鐵血紅素輔基的蛋白，即細胞色素類；3、活性中心含有銅的藍銅蛋白。和血紅蛋白、肌紅蛋白一樣，細胞色素類蛋白的活性中心也含有血紅素鐵，細胞色素類蛋白就是依靠血紅素鐵中鐵的價態(tài)變化來進行電子傳遞，包括電子從一種蛋白質(zhì)到另一種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移。1961年，國際生物化學學會把細胞色素定義為“一種血紅素蛋白，它的基本生物功能是通過分子中血紅素鐵的價態(tài)的可逆變化在生物體中起電子及氫的傳遞作用”。目前已知的細胞色素有50種以上。在生物體內(nèi)，根據(jù)所含血紅素輔基結(jié)構(gòu)的不同，將細胞色素分為：細胞色素a（包含血紅素a輔基）、細胞色素b（包含血紅素b輔基）、細胞色素c（包含血紅素c輔基）等。不同的生物體采用了不同的細胞色素系列來適應它們自身的需要。細胞色素參與線粒體內(nèi)膜上一整套電子傳遞鏈（生物氧化呼吸鏈）的最后幾步氧化還原反應，將電子最終傳遞給氧分子，使氧分子還原成水分子。一、細胞色素c

細胞色素c是相對分子質(zhì)量比較小且相對比較容易結(jié)晶的蛋白，它的分布非常廣，存在于從細菌、酵母、植物、無脊椎動物、脊椎動物到高等動物和人等所有的原核生物和真核生物中。細胞色素c是少數(shù)幾個被詳細研究的含金屬的生物大分子之一，現(xiàn)在已經(jīng)確定了幾十種不同來源的細胞色素c的氨基酸序列，每個細胞色素c分子含有一條蛋白鏈和一個血紅素c輔基。馬心的細胞色素c的分子質(zhì)量為12400Da，它由104個氨基酸殘基組成。圖5.1金槍魚細胞色素c（第一個測定結(jié)構(gòu)的細胞色素c）蛋白鏈蛋白鏈血紅素c輔基除了由兩個軸向配體與蛋白鏈連接外，卟啉環(huán)2,4-位以共價鍵形式與蛋白鏈中的兩個半胱氨酸連接。二、細胞色素c氧化酶－－細胞色素a和細胞色素a3

細胞色素c氧化酶是細胞色素c的氧化劑，它是需氧生物呼吸鏈中的最后一步氧化還原反應，它將還原態(tài)的細胞色素c催化氧化到氧化態(tài)的細胞色素c，同時將一分子氧還原為兩分子水，反應式為：4Fe(II)-cytc+O2+4H+4Fe(III)-cytc+2H2O細胞色素c氧化酶存在于細胞的線粒體膜上，該酶在催化氧化還原反應的同時還伴隨著質(zhì)子通過膜的轉(zhuǎn)移，即細胞色素c氧化酶同時具有電子轉(zhuǎn)移和質(zhì)子泵的雙重功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)細胞色素a和細胞色素a3都含有兩個金屬離子。細胞色素a不僅含有一個以血紅素a為輔基的鐵血紅素中心，還含有一個銅中心（CuA）；而細胞色素a3不僅含有一個以血紅素a3為輔基的鐵血紅素中心，還含有一個銅中心（CuB）。通過各種化學方法的研究，表征了細胞色素c氧化酶活性中心的結(jié)構(gòu)，尤其是金屬離子周圍的結(jié)構(gòu)。拉曼光譜、ESR等譜學研究表明，血紅素a中的鐵無論是氧化態(tài)還是還原態(tài)都處于六配位低自旋狀態(tài)。鐵離子除了與血紅素平面的四個氮原子配位之外，軸向兩個位置分別被來自于蛋白鏈中組氨酸側(cè)鏈上的咪唑氮原子占據(jù)。1、細胞色素aCuA中心的結(jié)構(gòu)由EXAFS、ESR以及利用同位素標記的氨基酸研究結(jié)果，并最終根據(jù)X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)結(jié)果確定為雙核結(jié)構(gòu)。雙核銅通過蛋白鏈中兩個半胱氨酸側(cè)鏈上的硫原子橋連，一個銅離子還與一個組氨酸和一個蛋氨酸配位，另一個銅離子還與一個組氨酸和一個主鏈上的羰基氧原子配位。細胞色素c氧化酶中CuA中心的配位結(jié)構(gòu)半胱氨酸組氨酸蛋氨酸磁性、ESR等研究發(fā)現(xiàn)氧化型細胞色素a3中的Fe和Cu之間存在較強的相互作用，推測Fe和Cu之間可能有某種橋連基團存在。這兩個非常接近的Fe和Cu氧化還原中心對氧分子的四電子還原過程的順利完成非常有利。2、細胞色素a3血紅素a3中的鐵在還原態(tài)時為高自旋的五配位構(gòu)型，除了血紅素平面四個氮原子與鐵配位外，一個軸向配體是組氨酸的咪唑氮原子，另一個軸向位置為空，因此很容易與CO、CN－等配體結(jié)合。譜學及晶體結(jié)構(gòu)研究推測，CuB中心的配位環(huán)境中有組氨酸的咪唑氮原子參與配位，在還原態(tài)時可能也有一個空位。三、細胞色素b5細胞色素b是一類含有原卟啉的電子傳遞蛋白，主要存在于線粒體內(nèi)膜。還原型細胞色素b的α、β和γ特征吸收帶分別在555～563nm、523～533nm和420～430nm。細胞色素b5是b類細胞色素中研究最多、了解最清楚的一種蛋白，多見于真核細胞，特別是動物的肝細胞中。細胞色素b5的蛋白鏈由133個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約16000Da。細胞色素b5與血紅蛋白、肌紅蛋白有一定的相似之處，也有明顯的不同。在細胞色素b5中，譜學測試、晶體結(jié)構(gòu)、溶液結(jié)構(gòu)研究證實鐵離子為配位飽和的六配位構(gòu)型，因此細胞色素b5難以自動氧化，不易與CO、CN－、N3－等外來配體結(jié)合。細胞色素b5中鐵無論是氧化態(tài)還是還原態(tài)都處于低自旋態(tài)。細胞色素b5中鐵離子除了與卟啉環(huán)平面的四個氮原子配位之外，軸向位置被兩個組氨酸側(cè)鏈上的咪唑氮原子占據(jù)。X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)表明，細胞色素b5中的血紅素位于疏水袋中，原卟啉的兩個丙酸基指向蛋白表面，處在與水可接觸的區(qū)域。血紅素周圍有四個α螺旋鏈存在，其底部有β折疊片存在，這樣就構(gòu)成了一個桶狀疏水空腔，血紅素輔基正好位于其中。小結(jié)：細胞色素a、細胞色素b、細胞色素c是包含血紅素輔基的一類金屬蛋白，它們依靠血紅素鐵的價態(tài)變化來進行電子傳遞。在線粒體內(nèi)膜上電子傳遞的順序為：細胞色素b細胞色素c1細胞色素c細胞色素氧化酶（細胞色素a細胞色素a3）氧分子第二節(jié)細胞色素P－450細胞色素P－450是于1958年在鼠肝微粒體中發(fā)現(xiàn)的一種以血紅素b為輔基的蛋白，它也是b類細胞色素中的一種。與細胞色素c、細胞色素b5等不同的是，細胞色素P－450在生物體系中不是電子傳遞蛋白，而是一種金屬酶，它催化某些有機底物分子的加氧反應。這種b類細胞色素之所以被稱之為細胞色素P－450，或簡稱P－450，是因為其在還原態(tài)下的一氧化碳（CO）加合物的Soret特征吸收帶出現(xiàn)在450nm處，其中P代表色素。細胞色素P－450的作用（功能）、結(jié)構(gòu)和作用機理在生物體系中，氧分子在酶的催化作用下氧化加合到有機底物分子中去的反應叫做加氧反應，催化該類反應的酶稱為加氧酶。自然界存在兩種加氧酶：一種是單加氧酶，即將氧分子中兩個氧原子中的一個氧原子催化加合到底物分子中，而另一個氧原子被轉(zhuǎn)換為水分子；另一種是雙加氧酶，即將氧分子中的兩個氧原子都加合到底物分子中。細胞色素P－450屬于單加氧酶，催化單加氧反應。反應式為：SH+O2+2H++2eSOH+H2O其中SH為底物分子。細胞色素P－450催化的反應是在底物分子中引入一個羥基，即底物分子進行羥基化反應，這種羥基化反應對各種有機分子在生物體系中的代謝具有重要作用。細胞色素P－450顯示出非常廣泛的底物分子特異性，底物分子可以包括脂肪環(huán)、脂肪鏈類碳氫化合物以及它們的衍生物、芳香族碳氫化合物及其衍生物等。細胞色素P－450催化的主要反應類型某些有機化合物由于不溶于水，使其在體內(nèi)難以代謝，而在細胞色素P－450單加氧酶作用下，使這些難代謝物進行羥基化，將其轉(zhuǎn)化成水溶性化合物。然后進一步與其他水溶性物質(zhì)結(jié)合，代謝后排出體外，這一代謝過程對哺乳動物十分重要。例如，在肝微粒體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種細胞色素P－450，可將外來有毒化合物、污染物等催化氧化成水溶性物種排出體外，從而起到保護機體不受傷害的作用。但是，也有一些本來沒有毒性或毒性較小的化合物經(jīng)過細胞色素P－450催化引入羥基之后反而變成毒性更大的化合物。生物體系中，在許多重要的代謝和生物合成中，細胞色素P－450起了非常重要的作用。例如，在腎上腺皮質(zhì)中，細胞色素P－450參與脂的代謝、膽甾醇的氧化等重要過程。這些反應中的氫供體主要有還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、還原型煙酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸鹽（NADPH）、還原型黃素蛋白、維生素C等。1、細菌單加氧酶，代表性的是茨酮-5-單氧酶；根據(jù)來源的不同，可將細胞色素P－450分為三類：2、腎上腺皮質(zhì)線粒體單加氧酶，催化的底物分子主要有孕甾酮和11-脫氧皮質(zhì)甾酮；3、肝線粒體單加氧酶，催化的底物分子種類較多，包括脂肪族化合物、藥物分子的羥化等。在細胞色素P－450參與的各種催化羥化反應中，研究最多、了解最清楚的是茨酮-5-單氧酶，反應式為：在黃素蛋白、鐵硫蛋白和細胞色素P－450的共同作用下，由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作為氫供體，在樟腦（2-茨酮）分子的5-位上進行立體選擇性羥基化反應，催化該反應的細胞色素P－450簡稱為P－450cam。通過ESR、EXAFS等譜學表征，細胞色素P－450的活性中心含有鐵和原卟啉，還原型的細胞色素P－450中鐵為高自旋，易與O2、CO、CN－等分子或離子結(jié)合，并轉(zhuǎn)變?yōu)榈妥孕?，這一現(xiàn)象與肌紅蛋白類似。X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)證明，血紅素鐵的軸向第五個配體來自于蛋白鏈上半胱氨酸殘基側(cè)鏈的硫原子。氧化型細胞色素P－450中在沒有底物分子存在的條件下，第六配體為水分子，而且在配位水分子附近聚集了數(shù)個水分子形成一個水分子簇和物。當有底物分子進入之后，水分子簇和物即被破壞，血紅素上方的空間被底物分子所占據(jù)。圖5.7未結(jié)合底物分子的細胞色素P－450血紅素活性中心的結(jié)構(gòu)圖5.7結(jié)合樟腦底物分子的細胞色素P－450血紅素活性中心的結(jié)構(gòu)小結(jié)：細胞色素P－450是以血紅素b為輔基的一類金屬蛋白，它是一種金屬單加氧酶，可以催化某些有機底物分子的加氧反應，使有機底物分子發(fā)生羥基化反應。該酶對于生物體系的代謝具有重要作用。第三節(jié)甲烷單加氧酶、雙加氧酶自然界存在兩種加氧酶：一種是單加氧酶，即將氧分子中兩個氧原子中的一個氧原子催化加合到底物分子中，而另一個氧原子被轉(zhuǎn)換為水分子；另一種是雙加氧酶，即將氧分子中的兩個氧原子都加合到底物分子中。一、甲烷單加氧酶細胞色素P－450能夠高效、特異性地催化許多有機化合物的羥基化反應，但是不能催化最簡單的碳氫化合物－－甲烷到甲醇的反應。催化氧化甲烷到甲醇的酶稱為甲烷單加氧酶。自然界中存在一類以甲烷為營養(yǎng)源的細菌，稱為甲烷營養(yǎng)細菌。這類細菌能夠氧化甲烷，將其轉(zhuǎn)化為生物體系可利用的碳源，在自然界碳元素的循環(huán)過程中具有重要的作用。甲烷的這一轉(zhuǎn)化過程還可以限制并減少甲烷氣體排入大氣層，從而減小由甲烷氣體引起的溫室效應。甲烷氧化轉(zhuǎn)化過程的第一步是在甲烷單加氧酶作用下的催化反應，將甲烷轉(zhuǎn)換為甲醇，反應式為：CH4+NADH+H++O2CH3OH+NAD++H2O目前已知的甲烷單加氧酶主要是可溶性的，含有一個雙核鐵活性中心。甲烷單加氧酶的底物分子不僅僅是甲烷，還有許多其他的碳氫化合物也能被甲烷單加氧酶催化。因此這類催化反應不僅在自然界有重要作用，而且具有許多重要的應用前景。例如，將土壤中非水溶性的碳氫化合物（污染物）等進行羥基化反應后變?yōu)樗苄晕镔|(zhì)，從而達到改良土壤的目的；將天然氣轉(zhuǎn)換為甲醇，將會徹底改善天然氣運輸困難的問題。甲烷單加氧酶是由多種蛋白組成的復合蛋白酶，它至少由三種蛋白組成：羥化酶、還原酶、結(jié)合蛋白。其中羥化酶含有一個雙核鐵活性中心，是發(fā)生催化反應的地方，而還原酶的作用是將由NADH提供的電子傳遞給羥化酶中的雙鐵活性中心。甲烷單加氧酶中的羥化酶、還原酶、結(jié)合蛋白示意圖晶體結(jié)構(gòu)解析顯示，羥化酶的活性中心含有一個雙鐵中心。二、雙加氧酶雙加氧酶可以將氧分子中的兩個氧原子同時加入到底物分子中，催化反應式為：SH+O2SO2H其中SH為底物分子。典型的雙加氧酶有鄰苯二酚氧酶、原兒茶酸根3,4-雙加氧酶等，均為非血紅素鐵酶，催化反應式為：其中O2*表示用同位素標記的氧原子，表明氧分子中兩個氧原子全加入到底物分子中。雙加氧酶的天然狀態(tài)為紅色，在450nm有寬吸收峰，研究表明這是由酪氨酸根配體到中心三價鐵的電荷轉(zhuǎn)移峰，并有ESR信號。原兒茶酸根3,4-雙加氧酶的晶體結(jié)構(gòu)顯示，其活性中心為單核鐵，其中有兩個組氨酸的咪唑氮原子、兩個酪氨酸側(cè)鏈上的氧原子參與和中心鐵的配位，另外一個配位原子是水分子或羥基。圖5.12原兒茶酸根3,4-雙加氧酶的活性中心結(jié)構(gòu)動力學研究等結(jié)果表明，底物分子與中心鐵離子結(jié)合形成一種催化反應中間體，該活性中間體中Fe(III)和配位的兒茶酚基團之間存在從配體到Fe(III)的電荷轉(zhuǎn)移，形成半醌類自由基的Fe(II)物種，從而有利于雙氧的親電進攻，最后形成氧化產(chǎn)物。圖5.12原兒茶酸根3,4-雙加氧酶催化反應中間體的結(jié)構(gòu)半醌細胞色素P－450、甲烷單加氧酶和雙加氧酶中，不論是將氧分子中的一個氧原子加入到底物分子，另一個氧原子被轉(zhuǎn)換為水分子，還是將氧分子中的兩個氧原子都加入到底物分子，其特點都是氧分子被四電子還原到氧負離子(O2-)狀態(tài)。從化學的角度看氧分子被徹底還原了，對生物體系來講這種氧的代謝屬于正常代謝