豬圓環(huán)病毒2型疫苗研究進(jìn)展

目錄圓環(huán)流行情況介紹A存在問(wèn)題及展望C國(guó)內(nèi)、外圓環(huán)疫苗情況B第一頁(yè)，共87頁(yè)。豬圓環(huán)病毒病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)影響性疾病，也是我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的三大疾病之一，與豬瘟和豬藍(lán)耳病并稱(chēng)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的三座大山。第二頁(yè)，共87頁(yè)。PMWSPCVAD第三頁(yè)，共87頁(yè)。第四頁(yè)，共87頁(yè)。第五頁(yè)，共87頁(yè)。

目前，對(duì)于豬2型圓環(huán)病毒（ＰＣＶ２）造成的相關(guān)疾病尚無(wú)有效的治療措施，而且圓環(huán)病毒對(duì)各種消毒劑都有很強(qiáng)的抵抗性，豬場(chǎng)難將其凈化，預(yù)防該病的首要方案是采用疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。第六頁(yè)，共87頁(yè)。PCV2屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是一種共價(jià)閉合、單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，呈二十面體對(duì)稱(chēng)，無(wú)囊膜。PCV2病毒粒子直徑為17nm，基因組大小約1.7kb，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。PCV2的基因組結(jié)構(gòu)存在11個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)，即ORF1-ORF11，ORFs之間大小相差懸殊，所編碼的蛋白大小在2～36ku。ORF1與ORF2是PCV2最大的２個(gè)開(kāi)放閱讀框，分別編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白Ｒep和Ｒep’以及病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Ｃap。第七頁(yè)，共87頁(yè)。第八頁(yè)，共87頁(yè)。第九頁(yè)，共87頁(yè)。Ｃap蛋白作為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，是PCV2的主要免疫保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，是研制PCV2基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原。ORF3為病毒復(fù)制的非必需基因，其編碼的蛋白可誘導(dǎo)PCV2感染的細(xì)胞發(fā)生凋亡。許多學(xué)者在PCV2基因組結(jié)構(gòu)與功能方面開(kāi)展了大量研究，除ORF1,ORF2與ORF3的功能研究較為透徹外，其他ORFs的功能尚不十分清楚。第十頁(yè)，共87頁(yè)。目前，國(guó)際上統(tǒng)一將PCV2分為PCV2a、PCV2b、PCV2c三個(gè)基因亞型，其中PCV2a和PCV2b是目前存在的主要基因型，PCV2a僅分離自無(wú)PMWS感染豬場(chǎng)，PCV2b多分離自PMWS發(fā)生的豬群，PCV2c亞型毒株僅在20世紀(jì)80年代于丹麥分離，在致病性方面未見(jiàn)報(bào)道。PCV2在世界范圍內(nèi)廣泛分布并且在豬群中存在至少有50多年，血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查己證實(shí)全世界范圍內(nèi)許多國(guó)家和地區(qū)的豬群均存在PCV2感染，幾乎100%的商品化養(yǎng)豬場(chǎng)感染過(guò)PCV2，嚴(yán)重影響世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。第十一頁(yè)，共87頁(yè)。目前對(duì)該病毒的防控主要依靠疫苗，滅活疫苗、亞單位疫苗和嵌合病毒滅活疫苗已投入使用，核酸疫苗、活載體疫苗和標(biāo)記疫苗等新型疫苗已成為PCV2疫苗研究的熱點(diǎn)。第十二頁(yè)，共87頁(yè)。PCV2國(guó)外流行情況

2003

2008OlveraPCV2aPCV2b第十三頁(yè)，共87頁(yè)。Dupont

等對(duì)GenBank中1997年至2006年間上傳的218個(gè)PCV2全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2003年前豬群中主要流行PCV2a,之后世界范圍內(nèi)豬群PCV2感染存在轉(zhuǎn)型趨勢(shì)，主要以PCV2b基因型流行為主，同時(shí)PCVAD臨床表現(xiàn)較2003年之前更為嚴(yán)重，但是這些國(guó)家不包括韓國(guó)、日本和澳大利亞。第十四頁(yè)，共87頁(yè)。

基于以上研究，TanjaOprissnig

等分析了1996-2013年間分離自美國(guó)和加拿大的750份樣品，1996-2004年間分離到的毒株均屬于PCV2a基因型，2005年出現(xiàn)新基因型PCV2b,2006-2013年的流行株為PCV2b基因型。第十五頁(yè)，共87頁(yè)。2012年５月，美國(guó)在一PCV2免疫失敗豬場(chǎng)首次分離到毒力均強(qiáng)于PCV2a和PCV2b的突變毒株(Mutantporcinecircovirustype2b,ｍPCV2b），由于美國(guó)商品化疫苗基于PCV2a

基因型，ｍPCV2b

毒株的發(fā)現(xiàn)讓人們更加關(guān)注當(dāng)前PCV2a型疫苗的免疫效果。第十六頁(yè)，共87頁(yè)。北美地區(qū)在2004年前僅流行PCV2a基因型,2005年爆發(fā)嚴(yán)重的PCVAD,PCV2b基因型替代PCV2a型在北美地區(qū)商業(yè)化豬場(chǎng)迅速蔓延，引起高發(fā)病率和死亡率。隨后在中國(guó)、泰國(guó)、韓國(guó)、丹麥、瑞士也相繼報(bào)道了PCV2b基因型的出現(xiàn)，并在一段時(shí)間內(nèi)與PCV2a基因型循環(huán)流行。第十七頁(yè)，共87頁(yè)。2007年Chae等在韓國(guó)分離到36株P(guān)CV2(PCVAD發(fā)病豬場(chǎng)分離到29株，PCVAD未發(fā)病豬場(chǎng)９株)，29株均屬于PCV2b，PCVAD未發(fā)病豬場(chǎng)中有4株屬于PCV2b。2006-2007年間，日本存在PCV2a與PCV2b兩種亞型，但是以PCV2b為主要流行基因型。第十八頁(yè)，共87頁(yè)。目前，PCV2b基因型替代PCV2a型成為優(yōu)勢(shì)基因型，有關(guān)PCV2流行毒株遺傳變異的報(bào)道也逐漸增多，在遺傳變異及免疫壓力下可能出現(xiàn)其它形式的突變毒株。2008年Ｈess等報(bào)道了PCV2a與PCV2b重組毒株，隨后有關(guān)不同PCV2b毒株之間以及PCV1與PCV2a之間毒株發(fā)生基因重組相繼報(bào)道。同時(shí)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，重組毒有很高的體外繁殖能力，且抗原性發(fā)生改變，這些改變對(duì)致病性的影響有待進(jìn)一步研究。第十九頁(yè)，共87頁(yè)。PCV2基因型的漂移最早起源于歐洲，發(fā)生于2003年或更早時(shí)間，北美洲和亞洲約發(fā)生于2005年，大洋洲發(fā)生這種優(yōu)勢(shì)流行株轉(zhuǎn)變約在2006年，時(shí)間上均比歐洲PCV2基因型的改變有輕微的推遲，潛在原因還未得到證實(shí)，可能與進(jìn)口處于該病潛伏期的動(dòng)物有關(guān)?；蛐桶l(fā)生漂移的同時(shí)伴隨著嚴(yán)重的圓環(huán)病毒病的爆發(fā)，雖然現(xiàn)有數(shù)據(jù)不能直接證明這些爆發(fā)是由PCV2b毒株導(dǎo)致，但是時(shí)間和地點(diǎn)上的巧合推測(cè)PCV2主導(dǎo)型的變化與PCVAD的發(fā)生存在很大關(guān)系，而基因型轉(zhuǎn)變的原因與機(jī)制目前尚不清楚。相對(duì)于PCV2遺傳變異，PCV2自然重組變異的報(bào)道比較少，其重組與病毒致病性和遺傳進(jìn)化的關(guān)系尚不明確。第二十頁(yè)，共87頁(yè)。我國(guó)PCV2流行情況Ｗang等從全國(guó)分離到49株P(guān)CV2，其中2001年分離到３株均屬于PCV2a型，2002-2006年分離到34株P(guān)CV2中PCV2b有18株，2007-2008年間分離到12株均為PCV2b型。Li對(duì)2001-2009年間分離自我國(guó)東部的136株P(guān)CV2進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，PCV2b有127株，PCV2a僅有9株，其中8株P(guān)CV2a分離自2001-2005年間，從2005年以后，幾乎所有的分離株都是PCV2b型，PCV2a型越來(lái)越少，中國(guó)東部地區(qū)PCV2流行毒株存在由PCV2a向PCV2b漂移的現(xiàn)象。第二十一頁(yè)，共87頁(yè)。王佳慧利用PCR方法對(duì)中國(guó)16個(gè)省市75個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)2010-2011年間的688份樣品進(jìn)行檢測(cè)，被檢豬場(chǎng)PCV2陽(yáng)性率為58.67%,共分離到53株P(guān)CV2,與GenBank下載的192株中國(guó)分離株進(jìn)行遺傳變異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，53株P(guān)CV2中PCV2b基因型有50株,且2001年前我國(guó)優(yōu)勢(shì)PCV2基因型為PCV2a型,2002年之后流行的PCV2基因型轉(zhuǎn)變?yōu)镻CV2b型,但同期仍有PCV2a型毒株存在。第二十二頁(yè)，共87頁(yè)。趙英杰對(duì)2011-2012年間采集自我國(guó)18個(gè)省市932份樣品分析發(fā)現(xiàn)，2011-2012年我國(guó)主要養(yǎng)豬地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)PCV2的感染率高達(dá)67.8%，并選取具有代表性的74株P(guān)CV2進(jìn)行全基因組測(cè)序，其中56株P(guān)CV2b基因型。同一時(shí)期，Wei等自我國(guó)南方14個(gè)商業(yè)化豬場(chǎng)分離到66株P(guān)CV2，其中92.42%的毒株屬于PCV2b基因型。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)優(yōu)勢(shì)流行基因型為PCV2b。第二十三頁(yè)，共87頁(yè)。目前，國(guó)外有很多關(guān)于PCV2流行毒株的變異的報(bào)道，但是我國(guó)對(duì)此研究比較少。2011年Cai分離到了5株P(guān)CV2a和PCV2b基因型間重組毒，重組位點(diǎn)均位于ORF2區(qū)段內(nèi)。Guo對(duì)2004-2008年采集自我國(guó)10個(gè)省份疑似PCV2感染的病料中分離到19株P(guān)CV2，有4株病毒ORF2編碼基因發(fā)生突變，同時(shí)選取了2株突變株進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)突變株所造成的病理?yè)p傷、病毒血癥、淋巴組織等免疫器官損傷明顯嚴(yán)重，新出現(xiàn)的突變株如何增強(qiáng)毒力的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。第二十四頁(yè)，共87頁(yè)。PCV2在我國(guó)豬群中已經(jīng)廣泛存在，主要有PCV2a和PCV2b兩種基因型，自2005以來(lái)主要以PCV2b基因型流行為主，同時(shí)出現(xiàn)mPCV2b毒株，未發(fā)現(xiàn)PCV2c基因型。第二十五頁(yè)，共87頁(yè)。國(guó)外上市疫苗有滅活疫苗、Cap亞單位疫苗和PCV1-2嵌合病毒滅活疫苗,均基于PCV2a基因型，雖然PCV2a疫苗能降低豬臨床PCVAD,減少PCV2a的流行,但是不會(huì)顯著減少PCV2b在豬群中的傳播。日本研究者發(fā)現(xiàn),PCV2疫苗的免疫效果與PCV2基因型有很大關(guān)系,流行毒株與疫苗株遺傳關(guān)系越近，疫苗產(chǎn)生的免疫保護(hù)效力越好。為了進(jìn)一步證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，TanjaOpriessniga用PCV2a型疫苗和PCV2b型疫苗分別免疫豬群，PCV2進(jìn)行攻毒，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV2b型疫苗可以抵抗PCV2b、PCV2a/PCV2b共感染提供更好的免疫保護(hù)。第二十六頁(yè)，共87頁(yè)。國(guó)內(nèi)上市疫苗屬于PCV2b型滅活疫苗，雖然與流行毒株屬于同一基因型，但是傳統(tǒng)滅活疫苗抗原制備上病毒滴度低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，且誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答主要為體液免疫，忽視了細(xì)胞免疫應(yīng)答在PCV2免疫保護(hù)中的作用。雖然商品化疫苗的應(yīng)用為有效防控PCV2感染發(fā)揮了重要作用，但是疫苗株與流行株分屬不同基因型，且傳統(tǒng)疫苗在免疫保護(hù)效力和生產(chǎn)制備上存在缺陷。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基于PCV2b型的活載體疫苗、核酸疫苗及標(biāo)記疫苗等新型疫苗也展現(xiàn)出良好的研究前景。第二十七頁(yè)，共87頁(yè)。PCV2滅活疫苗PCV2滅活疫苗是將PCV2感染的細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)理化方法處理，使其喪失感染性但仍保持良好的免疫原性，然后加入佐劑乳化制備而成。該類(lèi)疫苗具有使用安全，易于保存，性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。第二十八頁(yè)，共87頁(yè)。第二十九頁(yè)，共87頁(yè)。第三十頁(yè)，共87頁(yè)。第三十一頁(yè)，共87頁(yè)。第三十二頁(yè)，共87頁(yè)。第三十三頁(yè)，共87頁(yè)。國(guó)外學(xué)者較早投入PCV2滅活疫苗的研究工作中，法國(guó)梅里亞公司于2006年成功研制出通過(guò)歐盟認(rèn)證的首例PCV2全病毒滅活疫苗Circovac?。Opriessnig等研究發(fā)現(xiàn)，用Circovac?免疫妊娠母豬和仔豬均能降低仔豬PCV2病毒血癥和各組織器官中病毒載量，促進(jìn)新生仔豬的生長(zhǎng)，其原因可能是由于在給妊娠母豬注射疫苗后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了抗PCV2的特異性抗體，仔豬通過(guò)吮吸初乳獲得了抵抗PCV2感染的被動(dòng)免疫力。第三十四頁(yè)，共87頁(yè)。Kurmann用該疫苗免疫PCV2亞臨床感染的母豬，共分３次免疫，首免和二免分別在妊娠前４周和２周進(jìn)行，三免在妊娠期第12周進(jìn)行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫母豬的血清抗體水平比未免疫母豬的血清抗體水平提高了３～９倍，新生仔豬的血清抗體水平也隨之增加，并能提高仔豬平均日增重率，縮短仔豬育肥期。由此可見(jiàn)，Circovac?具備優(yōu)良的免疫效果，能使免疫母豬和免疫仔豬獲得穩(wěn)定的群體免疫力，保護(hù)其免受PCV2感染。第三十五頁(yè)，共87頁(yè)。在國(guó)內(nèi)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長(zhǎng)明研究員成功地研制出中國(guó)首例PCV2滅活疫苗(LG株)，該疫苗具有抗原含量高、免疫原性強(qiáng)、安全性好、抗母源抗體干擾及免疫效果好等特點(diǎn)，臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗接種豬群與空白對(duì)照組對(duì)比，主動(dòng)免疫仔豬發(fā)病率下降15.1%，死淘率下降3.6%；被動(dòng)免疫母豬結(jié)果顯示，出生時(shí)死胎率下降2.3%，初生仔豬成活率提高7.6%，斷奶時(shí)成活率提高7.5%。該疫苗的使用對(duì)我國(guó)PCV2流行有效地進(jìn)行防控，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。此外，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授研制的PCV2滅活疫苗（SH株）也已注冊(cè)上市，目前正在全國(guó)大部分地區(qū)推廣使用，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。這２種疫苗的成功研制和應(yīng)用對(duì)防控我國(guó)PCV2感染發(fā)揮了重大作用。第三十六頁(yè)，共87頁(yè)。第三十七頁(yè)，共87頁(yè)。第三十八頁(yè)，共87頁(yè)。第三十九頁(yè)，共87頁(yè)。第四十頁(yè)，共87頁(yè)。第四十一頁(yè)，共87頁(yè)。第四十二頁(yè)，共87頁(yè)。第四十三頁(yè)，共87頁(yè)。第四十四頁(yè)，共87頁(yè)。PCV2弱毒疫苗弱毒疫苗又稱(chēng)為減毒活疫苗，是將病原體的致病力通過(guò)自然篩選或人工致弱等方式減弱制備而成。盡管該類(lèi)疫苗的毒力已經(jīng)致弱，但仍然保持著原有的免疫原性，并能在動(dòng)物體內(nèi)繁殖，刺激動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生堅(jiān)實(shí)的免疫力和持久的保護(hù)力。第四十五頁(yè)，共87頁(yè)。國(guó)內(nèi)外對(duì)PCV2弱毒疫苗研究的報(bào)道較少，目前還沒(méi)有商品化的PCV2弱毒疫苗，主要原因與病毒毒力易返強(qiáng)、致弱毒株毒力評(píng)價(jià)困難等因素有關(guān)。Fenaux等將PCV2分離株在PK15細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第120代病毒(VP120)滴度約為第１代病毒(VP1)滴度的10倍，VP120感染的仔豬出現(xiàn)病毒血癥的發(fā)生率明顯低于VP1感染的仔豬，并且感染仔豬的血清中PCV2DNA拷貝數(shù)更低，眼觀和病理組織學(xué)變化也更輕，表明體外傳代可促進(jìn)PCV2在細(xì)胞內(nèi)的繁殖能力，并能減弱其致病力，這為研制PCV2弱毒疫苗提供了科學(xué)依據(jù)。由于單一PCV2感染對(duì)豬的致病性并不十分典型，病毒在體內(nèi)持續(xù)存在，其毒力是否返強(qiáng)等關(guān)鍵問(wèn)題沒(méi)有闡明，試驗(yàn)數(shù)據(jù)有限，這種方法得到的毒力減弱毒株作為疫苗離應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。第四十六頁(yè)，共87頁(yè)。PCV2亞單位疫苗Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護(hù)性抗原，能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)PCV2的特異性免疫應(yīng)答，是研制PCV2基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原。常用于PCV2亞單位疫苗生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要是昆蟲(chóng)細(xì)胞／桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。國(guó)外已有3種PCV2亞單位疫苗注冊(cè)上市，分別是勃林格公司研制的IngelvacCircoFLEX?，英特威公司研制的Circumvent?以及先靈葆雅公司研制的Porcilis?PCV，這3種疫苗均為桿狀病毒表達(dá)的Cap蛋白亞單位疫苗。第四十七頁(yè)，共87頁(yè)。Opriessnig等比較了單劑量的IngelvacCircoFLEX?和兩劑量的Circumvent?對(duì)３周齡以上仔豬的免疫保護(hù)效力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在用PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及豬流感病毒(SIV)感染免疫仔豬后，無(wú)論以單劑量還是兩劑量疫苗免疫，均能明顯降低病毒血癥的發(fā)生率，減輕PCV2、PRRSV及SIV混合感染對(duì)淋巴組織的損傷。第四十八頁(yè)，共87頁(yè)。Fort等研究了單劑量Porcilis?

PCV對(duì)不同地區(qū)、不同基因型PCV2感染的免疫保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗對(duì)來(lái)自不同地區(qū)、不同基因型的PCV2感染具有良好的免疫保護(hù)力，既能誘導(dǎo)免疫仔豬產(chǎn)生針對(duì)PCV2的特異性體液免疫應(yīng)答，又能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，能顯著減輕病毒血癥，減少鼻腔和排泄物中PCV2的排出量，降低各組織器官中PCV2的病毒載量。第四十九頁(yè)，共87頁(yè)。第五十頁(yè)，共87頁(yè)。第五十一頁(yè)，共87頁(yè)。

青島易邦生物工程有限公司常務(wù)副總經(jīng)理范根成博士介紹了易邦“易圓凈”擁有的幾個(gè)突出特點(diǎn)：1）率先建立豬圓環(huán)疫苗評(píng)價(jià)體系，引領(lǐng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；2）表達(dá)病毒樣顆?？乖╒LPS/CAP），抗原性好，能高效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好體液免疫與細(xì)胞免疫，免疫后15-20天100%轉(zhuǎn)陽(yáng)，持續(xù)時(shí)間可達(dá)5個(gè)月；3）水性佐劑+免疫增強(qiáng)劑，注射方便，無(wú)副反應(yīng)；4）100多萬(wàn)頭豬臨場(chǎng)使用表明“易圓凈”安全、高效、無(wú)副作用，免疫豬各項(xiàng)生產(chǎn)性能良好。只需一針，保護(hù)至出欄；5）2-4周齡豬免疫，每頭2ml；管理良好豬場(chǎng)每頭1-1.5ml；在未免疫或免疫失敗豬群，在發(fā)病早期可以緊急接種，每頭2ml。第五十二頁(yè)，共87頁(yè)。第五十三頁(yè)，共87頁(yè)。重組PCV2活載體疫苗PCV2病毒活載體疫苗腺病毒活載體疫苗偽狂犬病毒活載體疫苗假型桿狀載體疫苗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒載體疫苗噬菌體載體疫苗PCV2細(xì)菌活載體疫苗乳酸菌口服活載體疫苗博德特氏菌載體疫苗第五十四頁(yè)，共87頁(yè)。腺病毒活載體疫苗腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體具有諸多優(yōu)勢(shì)：宿主范圍廣，插入外源基因能力強(qiáng)，能在許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中表達(dá)重組蛋白，表達(dá)外源基因效率高，能對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行精細(xì)的修飾?；谝陨蟽?yōu)勢(shì)，腺病毒載體現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因工程疫苗研發(fā)，基因治療以及腫瘤治療等領(lǐng)域。第五十五頁(yè)，共87頁(yè)。Wang等成功構(gòu)建了表達(dá)PCV2ORF2基因的重組腺病毒rAD-Cap，然后通過(guò)動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)rAD-Cap對(duì)仔豬的免疫保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在首免后３７ｄ即能檢測(cè)到抗PCV2的高水平ELISA抗體和病毒中和抗體，免疫仔豬的相對(duì)日增體質(zhì)量率顯著高于攻毒對(duì)照組，而組織損傷程度和病毒血癥的發(fā)生率卻明顯低于攻毒對(duì)照組。第五十六頁(yè)，共87頁(yè)。Liu等成功構(gòu)建了融合表達(dá)PCV2ORF2基因與豬IFN-γ基因的重組腺病毒PCV2ORF2-IFN-γ，并證實(shí)PCV2ORF2-IFN-γ在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2特異性抗體的能力比單獨(dú)表達(dá)Cap蛋白的PCV2ORF2強(qiáng)，表明豬IFN-γ作為細(xì)胞因子佐劑可以顯著增強(qiáng)Cap蛋白的免疫原性。第五十七頁(yè)，共87頁(yè)。由此可見(jiàn)，表達(dá)Cap蛋白的重組腺病毒能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)PCV2的特異性免疫應(yīng)答，保護(hù)動(dòng)物抵抗PCV2感染，是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的PCV2候選疫苗。然而，腺病毒作為表達(dá)載體也存在些許不足，如腺病毒載體由于不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中，因此不能形成外源基因的穩(wěn)定表達(dá)；腺病毒的靶向性差；腺病毒顆?？杀桓闻K的Kupffer細(xì)胞非特異性吸收，表現(xiàn)出很強(qiáng)的首過(guò)效應(yīng)等。因此，只有對(duì)腺病毒載體不斷進(jìn)行改進(jìn)和完善，才能充分發(fā)揮其潛在的應(yīng)用價(jià)值。第五十八頁(yè)，共87頁(yè)。偽狂犬病毒活載體疫苗偽狂犬病毒基因組是線(xiàn)狀雙鏈DNA分子，大小約150ｋｂ，含有許多病毒非必需基因，可以插入和表達(dá)多種病原體的免疫保護(hù)性抗原基因。偽狂犬病毒較穩(wěn)定，免疫原性持久；缺失毒力基因的偽狂犬病毒安全性好，能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此，該病毒已逐漸發(fā)展成為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的高效表達(dá)載體之一，廣泛應(yīng)用于基因工程藥物和基因工程疫苗的開(kāi)發(fā)與研制等領(lǐng)域。第五十九頁(yè)，共87頁(yè)。Ju等成功構(gòu)建了表達(dá)PCV2ORF1-ORF2融合蛋白的重組偽狂犬病毒PRV-PCV2，Westernblot試驗(yàn)證實(shí)ORF1-ORF2融合蛋白在重組病毒中正確表達(dá)，用PRV-PCV2免疫小鼠后，能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PRV-PCV2的特異性抗體，保護(hù)小鼠抵抗PRVEa強(qiáng)毒株攻擊；而且，仔豬免疫試驗(yàn)也證實(shí)PRV-PCV2能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生針對(duì)PRV和PCV2的特異性免疫應(yīng)答。第六十頁(yè)，共87頁(yè)。Song等將PCV2ORF2基因插入ｐIECMV質(zhì)粒中，并同偽狂犬病毒Tk-/gE-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，通過(guò)同源重組成功構(gòu)建了Tk-/gE-/ORF2重組病毒，Westernblot和間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)PCV2ORF2基因在重組病毒中正確表達(dá)。４周齡仔豬接種Tk-/gE-/ORF2后，PRV-ELISA、PRV－中和試驗(yàn)、ORF2-ELISA和ORF2特異性淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)證實(shí)重組病毒具有良好的免疫原性，能產(chǎn)生針對(duì)PRV和PCV2的特異性免疫應(yīng)答。由此可見(jiàn)，重組偽狂犬病病毒能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)PRV和PCV2的特異性免疫應(yīng)答，保護(hù)動(dòng)物抵抗PRV和PCV2感染，與重組腺病毒對(duì)比，該重組偽狂犬病毒能在豬體內(nèi)很好地繁殖，因此，在PRV-PCV2二聯(lián)活載體疫苗研制方面具有巨大的潛力和應(yīng)用價(jià)值。第六十一頁(yè)，共87頁(yè)。假型桿狀病毒載體疫苗Ｆan等將水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac１多角體蛋白基因啟動(dòng)子下游，并在VSV-G表達(dá)元件下游引入巨細(xì)胞病毒早期（CMV-1E）啟動(dòng)子和BGHpoly(A)

,成功構(gòu)建了一種類(lèi)似桿狀病毒的假型桿狀病毒BV-G-CMV，但其能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并能在病毒粒子囊膜展示VSV-G。第六十二頁(yè)，共87頁(yè)。隨后，F(xiàn)an等將PCV2ORF2基因定向插入BV-G-CMVCMV-1E啟動(dòng)子下游，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞后獲得了重組假型桿狀病毒BV-G-ORF2，Westernblot與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示BV-G-ORF2能在PK15細(xì)胞中高效表達(dá)Cap蛋白。第六十三頁(yè)，共87頁(yè)。以1×108或1×109PFU劑量的BV-G-ORF2免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗PCV2特異性ELISA抗體、中和抗體及細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且即使以1×108PFU劑量免疫，BV-G-ORF2也展現(xiàn)出比PCV2DNA疫苗更強(qiáng)的免疫原性。BV-G-CMV作為基因轉(zhuǎn)移載體具有操作簡(jiǎn)單、病毒易培養(yǎng)、無(wú)毒性、免疫原性強(qiáng)及宿主體內(nèi)不存在抗桿狀病毒的抗體等優(yōu)點(diǎn)，因此，假型桿狀病毒可用于新型PCV2活載體疫苗的研究。第六十四頁(yè)，共87頁(yè)。豬繁殖與呼吸綜合征病毒載體疫苗Pei等在PRRSV

cDNA克隆的ORFs1b與2a之間插入２個(gè)限制性酶切位點(diǎn)和１個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列TRS6，將其改造成一個(gè)通用的病毒載體，然后將PCV2ORF2基因插入２個(gè)限制性酶切位點(diǎn)之間，由TRS6啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建了表達(dá)Cap蛋白的重組質(zhì)粒，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞成功獲得了P129-PCV重組PRRSV。第六十五頁(yè)，共87頁(yè)。動(dòng)物免疫試驗(yàn)證實(shí)：免疫５周后，在P129-PCV免疫的豬體內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PCV2特異性抗體應(yīng)答，表明重組PRRSV能在體內(nèi)和體外成功表達(dá)Cap蛋白，并誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答，可作為一種表達(dá)載體用于PCV2及其他豬病活載體疫苗的研究。然而，該重組PRRSV體外傳代是否穩(wěn)定、目的基因經(jīng)傳代是否會(huì)丟失等問(wèn)題有待進(jìn)一步的試驗(yàn)數(shù)據(jù)加以證實(shí)。第六十六頁(yè)，共87頁(yè)。

噬菌體載體疫苗研究表明，噬菌體表面展示技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于疫苗的開(kāi)發(fā)與研究。將病原體的保護(hù)性抗原與噬菌體的外殼蛋白以融合蛋白形式展示于噬菌體的表面，以此來(lái)構(gòu)建表達(dá)外源抗原的重組噬菌體顆粒，即噬菌體載體疫苗。噬菌體載體疫苗因安全，穩(wěn)定，不需要佐劑及易于規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)而日益受到研究人員的重視。第六十七頁(yè)，共87頁(yè)。Gamage等將PCV2Cap蛋白的優(yōu)勢(shì)表位區(qū)克隆至λ噬菌體展示顆粒(LDP)頭部蛋白(D)基因下游形成融合基因，成功構(gòu)建了表達(dá)融合蛋白D-CAP的重組λ噬菌體展示載體LDP-D-CAP，ELISA和Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示D-CAP在LDP的表面正確表達(dá)，用LDP-D-CAP免疫仔豬后，沒(méi)有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，首免后即可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PCV2的特異性免疫反應(yīng)，不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2中和抗體，而且能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，表明PCV2噬菌體載體疫苗有望作為一種新型的活載體疫苗用于防控PCV2感染。第六十八頁(yè)，共87頁(yè)。

乳酸菌口服活載體疫苗乳酸菌在食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用，是一類(lèi)安全的口服細(xì)菌，可以作為活疫苗載體表達(dá)外源抗原，因而日益受到研究者的重視。Wang等將缺失核定位信號(hào)區(qū)的PCV2ORF2基因克隆入大腸桿菌／乳酸鏈球菌穿梭載體pSEC:LEISS，構(gòu)建了重組穿梭載體pSEC:LEISS-dCap,電轉(zhuǎn)化乳酸菌后獲得了重組乳酸菌NZ9000/pSEC:LEISS-dCap,Westernblot試驗(yàn)證實(shí)Cap蛋白在乳酸鏈球菌中正確表達(dá)，在給小鼠口服重組乳酸鏈球菌培養(yǎng)物后可檢測(cè)到高水平的PCV2特異性抗體，表明乳酸鏈球菌作為抗原轉(zhuǎn)移載體可用于PCV2口服活疫苗的研發(fā)，具有開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景。第六十九頁(yè)，共87頁(yè)。博德特氏菌載體疫苗研究證實(shí)，支氣管炎博德特氏菌具有很強(qiáng)的感染性，這使得其很容易定植于呼吸道黏膜，因此，應(yīng)用致弱的支氣管炎博德特氏菌作為活載體將異種抗原遞呈至哺乳動(dòng)物乃至人的呼吸道是可以實(shí)現(xiàn)的。Kim等將PCV2ORF2基因定向克隆入aroA突變的支氣管炎博德特氏菌，電轉(zhuǎn)化后獲得了表達(dá)Cap蛋白的重組博德特氏菌(BBS-MCP)，然后用活BBS-MCP免疫小鼠和豬，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示在血清中存在高水平的抗Cap蛋白特異性IgG抗體，用PCV2感染后，在活BBS-MCP免疫的豬淋巴結(jié)中檢測(cè)不到PCV2DNA，結(jié)果表明BBS-MCP免疫能有效保護(hù)豬群抵抗PCV2感染，這一發(fā)現(xiàn)為PCV2減毒活疫苗的研發(fā)提供了新的思路。第七十頁(yè)，共87頁(yè)。此外，酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，因其操作簡(jiǎn)單、細(xì)胞生長(zhǎng)快速、能大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，而且能對(duì)重組蛋白進(jìn)行相對(duì)正確的折疊和翻譯后加工修飾等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于外源蛋白的商品化疫苗研發(fā)。Bucarey等將PCV2Cap蛋白基因密碼子優(yōu)化后克隆入大腸桿菌／釀酒酵母穿梭載體(pYES2)，然后轉(zhuǎn)化宿主菌INVSc1，Westernblot試驗(yàn)證實(shí)Cap蛋白在酵母細(xì)胞中正確表達(dá)，電鏡下觀察到Cap蛋白表達(dá)后可以自我組裝形成類(lèi)似PCV2的病毒樣顆粒，給小鼠口服含Cap蛋白的酵母提取物后，在血清中可檢測(cè)到抗Cap蛋白的特異性抗體，表明釀酒酵母作為一種非常有吸引力的表達(dá)載體可用于PCV2口服活疫苗的研制。第七十一頁(yè)，共87頁(yè)。

PCV2核酸疫苗核酸疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，因免疫效果好，免疫應(yīng)答持久，制備簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性強(qiáng)，安全性好，成本低廉，適于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為疫苗學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究證實(shí)，含PCV2ORF2基因的質(zhì)粒載體（ｐORF2）能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)PCV2特異性抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生抗PCV2感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答，而且ｐORF2免疫的小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2中和抗體的能力比單獨(dú)用Cap蛋白免疫的小鼠強(qiáng)，攻毒后免疫組小鼠臨床癥狀和病理變化明顯減輕，PCV2病毒載量也顯著下降。第七十二頁(yè)，共87頁(yè)。Fenaux等用PCV1-2嵌合病毒DNA疫苗免疫仔豬，免疫后42d，檢測(cè)到大部分仔豬PCV2抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，攻毒后21d，對(duì)照組仔豬出現(xiàn)病毒血癥，淋巴結(jié)腫大，淋巴組織衰竭等癥狀，而免疫組仔豬未出現(xiàn)病毒血癥，淋巴組織損傷程度較輕，淋巴組織的病毒載量顯著降低，表明PCV1-2嵌合病毒DNA疫苗可以有效預(yù)防PCV2感染。第七十三頁(yè)，共87頁(yè)。Ａｒａｖｉｎｄａｒａｍ等分別構(gòu)建了含PCV2ORF-1、ORF-2、ORF-3的重組質(zhì)粒p3224-ORF-1、-2和-3，3種重組質(zhì)粒單獨(dú)或聯(lián)合免疫小鼠２周后，用相應(yīng)的MVA-ORF-1、-2和-3以單獨(dú)或聯(lián)合形式加強(qiáng)免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF-2/-3與ORF-1/-2/-3這２種組合免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF以及PCV2抗體水平均較其它免疫組高，攻毒后這２種組合免疫組PCV2病毒載量顯著減少，小鼠的肺部病變也明顯減輕。盡管核酸疫苗具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但外源基因在體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控及其在體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移可能會(huì)產(chǎn)生意外的免疫病理反應(yīng)等瓶頸問(wèn)題使得目前絕大部分核酸疫苗的研究還僅局限于實(shí)驗(yàn)室。第七十四頁(yè)，共87頁(yè)。PCV1-2嵌合疫苗嵌合疫苗是應(yīng)用基因工程手段來(lái)構(gòu)建的一類(lèi)新型疫苗，美國(guó)富道公司已經(jīng)研發(fā)出商品化的PCV1-2嵌合疫苗Suvaxyn?PCV2OneDoseTM，其原理是用PCV2ORF2基因置換無(wú)致病性的PCV1ORF2基因，構(gòu)建PCV1-2嵌合病毒，然后將其滅活制備而成，該類(lèi)疫苗現(xiàn)已在美國(guó)、加拿大、墨西哥、丹麥、菲律賓及新西蘭等國(guó)申請(qǐng)注冊(cè)。2011年，美國(guó)輝瑞公司與富道公司合并后，將Suvaxyn?PCV2OneDoseTM更名為FosteraTMPCV。第七十五頁(yè)，共87頁(yè)。Ｓｅｇａｌéｓ等對(duì)Suvaxyn-PCV2的免疫保護(hù)效力進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫豬群的臨床癥狀大大減輕，淋巴組織和血液中PCV2的病毒載量、保育豬和育肥豬的死亡率以及PMWS的發(fā)生率均顯著降低，表明Suvaxyn-PCV2能有效誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生PCV2中和抗體，保護(hù)豬群抵抗PCV2感染，并降低PMWS的發(fā)生率，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致。第七十六頁(yè)，共87頁(yè)。眾所周知，如果仔豬體內(nèi)存在母源抗體，將會(huì)干擾疫苗的免疫效能，為驗(yàn)證母源抗體的存在對(duì)Suvaxyn?PCV2OneDoseTM免疫效能的影響，Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇ等選擇有母源抗體存在的仔豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在Suvaxyn?PCV2OneDoseTM免疫后28d進(jìn)行PCV2感染試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組對(duì)比，免疫組仔豬血清中PCV2病毒載量顯著降低，淋巴組織損傷程度也明顯減輕，表明即使存在母源抗體，Suvaxyn?PCV2OneDoseTM仍能顯著提高仔豬對(duì)PCV2感染的免疫力。第七十七頁(yè)，共87頁(yè)。第七十八頁(yè)，共87頁(yè)。

PCV2標(biāo)記疫苗PCV2標(biāo)記疫苗是指應(yīng)用DNA重組技術(shù)將分子標(biāo)記插入PCV2基因組中而研制的一類(lèi)新型的重組疫苗，該類(lèi)疫苗毒株可與野毒株相區(qū)別。第七十九頁(yè)，共87頁(yè)。Beach等將GLU或