哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

本文格式為Word版，下載可任意編輯——哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求

(一)營養(yǎng)成分

細(xì)胞生長繁殖所需要的營養(yǎng)成分包括氨基酸、單糖、維生素、無機(jī)離子和H2O。

氨基酸和維生素的添加量是有限的，某些氨基酸和維生素的添加量往往是憑經(jīng)驗(yàn)的，尋常與某個(gè)細(xì)胞系的建立過程有密切關(guān)系。例如，F(xiàn)isher’s培養(yǎng)基含有高濃度的葉酸，這是由于L5178Y對葉酸的依靠性，在這種培養(yǎng)基的發(fā)展過程中，葉酸就被沿用下來了。

大多數(shù)細(xì)胞的培養(yǎng)基都含有葡萄糖作為能量來源，葡萄糖的主要代謝途徑是通過無氧酵解產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可轉(zhuǎn)化為乳酸鹽或乙酰乙酸鹽，然后進(jìn)入檸檬酸循環(huán)被氧化成CO2和H20。培養(yǎng)基中乳酸的累積在培養(yǎng)胚胎及轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)尤為明顯，提醒體外培養(yǎng)時(shí)檸檬酸循環(huán)不能像多細(xì)胞機(jī)體內(nèi)那樣完全進(jìn)行。有證據(jù)說明，碳源的大部分來自谷氨酰胺而非葡萄糖。這也解釋了為何某些培養(yǎng)的細(xì)胞對谷氨酰胺和谷氨酸鹽的需求異常高。

(二)促生長因子及激素

促生長因子及激素在商品干粉培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中一般都不添加，含血清培養(yǎng)液的來源正是血清本身。在無血清培養(yǎng)基中+經(jīng)常需要添加這些組分。自然凝集的血清，與利用物理方法如離心法去除細(xì)胞得到的血漿相比，對于刺激細(xì)胞的增殖，效果更好。原因是，自然凝集的血清保存了更多的生長因子，如血小板生長因子。

(三)滲透壓和pH

培養(yǎng)基中基礎(chǔ)平衡鹽溶液組成的鹽類是維持滲透壓平衡的主要化合物，這些鹽類主要包括Na一、K+、Mg2+、Cl一、SO42-、Ca2+、POi和HCO3-等。

大部分培養(yǎng)基的鹽濃度是依據(jù)Eargle’s和Hank’s平衡鹽溶液而來，

，

Eargle’s平衡鹽溶液的Hanks濃度高，適合5％CO2的氣體環(huán)境。Hank’s平衡鹽溶液的HCO3-濃度低，適

用于空氣環(huán)境。5％CO2的氣體環(huán)境中，培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定及調(diào)理依靠于溶解在培養(yǎng)液的CO2氣體和組成培養(yǎng)基基礎(chǔ)平衡鹽溶液的緩沖作用。

酚紅是常用的pH指示劑，一般培養(yǎng)液中都有添加，pH7．4呈紅色，pH7．O變橙色，pH6．5變黃色，而pH7．6呈紅色中略帶藍(lán)色．pH7．8呈紫色。由于對顏色的觀測有很大的主觀性，因而建議操用無菌平衡鹽溶液和同樣濃度的酚紅配一套標(biāo)準(zhǔn)色標(biāo)，密封放在與存放培養(yǎng)液一致材質(zhì)的瓶子中。

NaHCO3的濃度取決于氣相中的CO2濃度，NaHCO3除了具有pH緩沖能力以外，還有顯著的營養(yǎng)作用。Ca2+是某些細(xì)胞黏著能力所必需。如在懸浮培養(yǎng)時(shí)，減少Ca2+可以減少細(xì)胞的聚集和附著。

(四)無毒、無污染殘留

培養(yǎng)液可以直接購買商品培養(yǎng)液，也可在購買商品干粉培養(yǎng)基后自行配制。提防使用配制用水是避免細(xì)胞毒性二價(jià)離子、有毒有機(jī)物和微生物污染的關(guān)鍵措施。細(xì)胞毒性二價(jià)離子一般指ca〞、Mg’以外的二價(jià)金屬離子，它們往往屬于微量元素，過量了簡單導(dǎo)致細(xì)胞中毒，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)諸如細(xì)胞生長分裂受阻、細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象。

保存這些培養(yǎng)液的試劑瓶是否清白無菌也顯得十分重要，并且試劑瓶是否在常溫下會溶出細(xì)胞毒性物質(zhì)也是選擇何種試劑瓶的原則之一。一般建議使用玻璃試劑瓶或無細(xì)胞毒性的工程塑料制造的試劑瓶。

由于塑料試劑瓶反復(fù)使用時(shí)簡單釋放出有害物質(zhì)，故不建議反復(fù)使用。玻璃試劑瓶在反復(fù)使用過程中，清洗時(shí)特別注意排除清洗劑殘留和金屬離子殘留。某些清洗劑不宜用于玻璃試劑瓶的清洗，如洗潔精含芳香類有機(jī)物、洗衣粉含酶類物質(zhì)，這些物質(zhì)在器皿清洗過程中，很難清除完全，簡單導(dǎo)致二次污染。一般建議使用玻璃清洗劑、洗衣皂、去污粉等一類清潔劑。

(五)抗生素

常用的細(xì)胞培養(yǎng)用抗生素中，可以只使用一種，如單一使用慶大霉素或卡那霉素都比較實(shí)用便利。

多數(shù)狀況下，抗生素的添加都源于習(xí)慣，因此，對于受過專業(yè)、系統(tǒng)訓(xùn)練的操而言，可以不需要直接添加抗生素到培養(yǎng)液中。換言之，在培養(yǎng)液購買或利用干粉配制液體培養(yǎng)基時(shí)，添加抗生素不是必需的，主要依據(jù)操的熟練程度和操作習(xí)慣決定。

不建議添加的理由主要有以下幾個(gè)方面：

①無菌操作的客觀條件和無菌操作技術(shù)日臻成熟，在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作，尋常不太簡單帶來微生物污染。

②大多數(shù)時(shí)候，某些抗生素的抗菌譜是有限的，某些環(huán)境微生物假使屬于抗藥菌，則添加的抗生素?zé)o效。經(jīng)常使用某些抗生素，簡單誘導(dǎo)產(chǎn)生培養(yǎng)環(huán)境的抗藥菌。使用某些抗生素對培養(yǎng)細(xì)胞的生長與分裂也會產(chǎn)生一定的影響。③抗生素在低濃度下，其生物活性的半衰期更短，需要頻繁添加，增加操作難度。

④使用抗生素可以掩蓋低程度的微生物污染。⑤霉菌和酵母的污染很難使用抗生素控制