DB33T 2287-2020羅氏沼蝦雙順反子病毒-1 檢測規(guī)程

浙江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布CSB浙江省地DB33方標(biāo)準(zhǔn)DBT2287—2020前言T浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。由浙江省水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。草單位：浙江省淡水水產(chǎn)研究所。引言效性和范圍無任何立場。人：浙江省淡水水產(chǎn)研究所羅氏沼蝦雙順反子病毒-1檢測規(guī)程-1檢測程序的構(gòu)成、試劑和材料、器材與設(shè)備、操作步驟和結(jié)果判定。標(biāo)準(zhǔn)適用于羅氏沼蝦雙順反子病毒-1的檢測及關(guān)聯(lián)疾病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和監(jiān)測。范性引用文件，GBT682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SCT03水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SCT02.1斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒病診斷規(guī)程第1部分：壓片顯微鏡檢查法定義taihuvirus，MrTV)，屬于小RNA病毒目、雙順反子病毒科、急麻病毒屬，病毒粒子為無囊膜的直徑約30nm的二十面體球形顆粒，核酸類型為單股正鏈RNA，長度約10.3kb。其主要侵染羅氏沼蝦幼體甲殼下上皮組織和神經(jīng)節(jié)，造成肝臟和結(jié)締組織出現(xiàn)強(qiáng)嗜堿性細(xì)胞質(zhì)包涵體。4縮略語。bp：堿基對(duì)(Basepair)DEPC：焦乙酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate)DNA：脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)dATP：脫氧腺苷三磷酸(Deoxyadenosinetriphosphate)dCTP：脫氧胞苷三磷酸(Deoxycytidinetriphosphate)dGTP：脫氧鳥苷三磷酸(Deoxyguanosinetriphosphate)dNTP：脫氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleosidetriphosphate)dTTP：脫氧胸苷三磷酸(Deoxythymidinetriphosphate)EB化乙啶，核酸染色劑(Ethidiumbromide)achiumrosenbergiidicistrovirusMrTV：羅氏沼蝦太湖病毒(Macrobrachiumrosenbergiitaihuvirus)M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus)RdRp：RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase)RNA：核糖核酸(Ribonucleicacid)RNasin：核糖核酸酶抑制劑(RNaseinhibitor)RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)Taq：水生噬熱桿菌(Thermusaquaticus)程序流程圖和材料9.LTaqDNA聚合酶：5U/L，－20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。GTAGAGCGTGGAGGAGTAAAACACTATCTCTGTCTTCGAGGGATTTTCTATTTCGGCTCGCGAATTAGGGAGAGGLLZ最低可設(shè)定溫度－86℃。Lt研磨器。LV安全柜或超凈工作臺(tái)。L控溫水浴鍋或加熱模塊。LL移液器。L泳儀。LL平電泳槽。LLL透射儀或凝膠成像儀。LLZ爐。操作步驟L樣品的準(zhǔn)備SCTSCT1的規(guī)定。4瓊脂糖電泳鮮活幼體、仔蝦及體長在3cm以下稚蝦個(gè)體樣品約30mg~50mg(去掉稚蝦眼)；成蝦取約30mg~mg－20℃。2RNA模板的提取L8.3RT-PCR操作.3.1cDNA合成對(duì)每一份樣品，在一支無RNA酶的0.2mLPCR管中，加入1.5L10M引物MrTV572R1，2.5L無NA L5×M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、1LRNasin(40U/L)、0.5L10mmol/LdNTPs、0.5LM-MLVrTVFLMMrTVRLTaqDNAULc7分鐘。LMMrTVFLMMrTVR2、1LTaqDNA聚合酶(5U/L)、41.0Lc7分鐘。用1×電泳緩沖液(1×電泳緩沖液的配制按附錄A中A.3進(jìn)行)配制2%的瓊脂糖凝膠(含0.5g/mLBAA緩沖液剛好淹沒膠面，將5LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和1L6×載樣緩沖液(6×載樣緩沖液配制按附錄A中A.5拍照記錄。9結(jié)果判定題排除PCR增：陽性對(duì)照和陽性照在572bp處無任何條帶，以無RNA酶水為模板設(shè)立的空白對(duì)照無任何條帶第二輪PCR擴(kuò)增：陽性對(duì)照在472bp處會(huì)有特定條帶出現(xiàn)；陽性樣品在在472bp處無任何條帶，以無RNA酶水為模板設(shè)立的空白對(duì)照無任何條帶出3．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物成份抑制PCR。產(chǎn)物或純化cDNA。陰性對(duì)照組或空白對(duì)照組在第一PCR72bp處有特定條帶；第二次PCR擴(kuò)增后在472bp處有條帶出及所用儀器設(shè)備。題排除APCR介入。2.檢查逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑，重新合成性對(duì)照和樣品出現(xiàn)較多雜帶或明顯的1．未注意低溫操作，使PCR出現(xiàn)非特2．酶活性變化、dNTPs濃度變化或10混物制備的準(zhǔn)確性、試劑質(zhì)EB量，將瓊脂糖凝膠置于清化乙錠(EB)。A(規(guī)范性附錄))RNA在無RNA酶的玻璃量筒中配制，混勻，按1.0mL/支分裝于無RNA酶的1.5mL微量離心管中，保存于A.2無RNA酶的水水PCmLRNAA.31×電泳緩沖液s5mol/LEDTA(pH8.0)A.410mg/mLEB貯存液水A.56×載樣緩沖液40g(規(guī)范性附錄)B般介紹外源性的RNA酶污染是指來自于水、玻璃制品、塑料器皿、電泳槽、操作人員和微生物等。可通過DEPC本附錄主要介紹外源性RNA酶的消除方法。B液配制CDEPCTris應(yīng)使用經(jīng)DEPC處理的水配制，然后經(jīng)無RNA酶的0.22m微孔濾膜過濾除菌。B璃制品金屬制品也可按玻璃制品的辦法處理。B丙烯塑料制品DEPC的水中浸泡12小時(shí)，然后經(jīng)高壓蒸汽滅菌，最后烘干。B工操作落塵帶入RNA酶的污染，必要的情況下戴口罩和實(shí)驗(yàn)帽，或在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作。B微生物污染(資料性附錄)(GeneBank登錄號(hào)：NC_018570)ATGTAGAGCGTGGAGGAGTAAAAGTAGATATAGTTATTTGCGAATTAGGTGCTTCTATTTMrTV572F1MrTV472F24642GTTTAATGGCTAACGGTGAGTTAAGAGTATTTACAACAACCAATTTTGGTAAATTCAATT4702TTCTAATTCCCAAAGATTCTTCTGCTATCTTTACTAGGGTTGTGGATCATGTAGAGTCTA4762GATCACCAGAAGGTTCTTCGTATTATATAAGGCAAGGTTTTGAAGCAAAGGGAAATTCTG4822TTCATGGTGATTGTTGTGCTCCCTACATAATGTTTAATCCGTCTTCGCGTGCTAAGATTG4882TGGGTCTCCATTGTGCTGGATTTGCTCAGACATCTCGAGTGTTTGCTCAAATGATAACGC4942AGGAGGATATTGCTAGTGCTATGCCCACAACTCATGCAGGACGAGTTTC