酶的化學修飾前理論后例子課件

第六章酶蛋白的化學修飾1、概念凡通過化學基團的引入或除去而使蛋白質（酶）共價結構發(fā)生改變，從而改變蛋白質（酶）的某些特性和功能的過程都可稱蛋白質（酶）的化學修飾。一、酶的化學修飾2、酶的化學修飾的目的和意義①目的：構象優(yōu)化、結構穩(wěn)固1．穩(wěn)定性不夠，不能適應大量生產(chǎn)的需要。2．作用的最適條件不符。3．酶的主要動力學性質的不適應。4．臨床應用的特殊要求。②意義：A.天然酶的活性維持存在缺陷；（如：異體蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制劑抑制、活性半衰期短）（1）分子生物學水平，即用基因工程方法對DNA或RNA進行分子改造，以獲得化學結構更為合理的酶蛋白（蛋白質工程）。（2）對天然酶分子進行改造，這包括一級結構中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側鏈修飾等（選擇性化學修飾）。

3、酶修飾途徑1．如何增強酶天然構象的穩(wěn)定性與耐熱性2．如何保護酶活性部位與抗抑制劑3．如何維持酶功能結構的完整性與抗蛋白水解酶4．如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境三．酶化學修飾的基本原理（1）酶分子的表面修飾：1）化學固定：酶與惰性載體共價固定（即共價固定化酶）；四、酶蛋白修飾的方法3）大分子修飾非共價修飾:與大分子物質非共價結合，增加酶的穩(wěn)定性;共價修飾:用可溶性大分子共價連接于酶分子表面，形成覆蓋層.4）分子內(nèi)交聯(lián)：增加酶分子表面基團相互交聯(lián)，穩(wěn)定酶分子；5）分子間交聯(lián)：用雙功能或多功能試劑使不同的酶交聯(lián)起來產(chǎn)生雜化酶7）反相膠團微囊化：在非極性有機溶劑中加表面活性劑與酶形成含水分子的反相膠團，酶分配在團內(nèi)的水性環(huán)境中，使酶與有機相分開，避免酶變性。1）非催化活性基團的修飾：如金屬離子置換修飾，可改變酶動力學性質和酶親和能力；2）酶蛋白主鏈修飾：有限水解修飾；3）催化活性基團修飾：選擇性修飾側鏈成分來實現(xiàn)氨基酸的取代，即化學突變法；4）肽鏈伸展后的修飾：為了有效處理酶分子內(nèi)部區(qū)域，先用脲、鹽酸胍處理酶，使酶鏈充分伸展，修飾后再折疊成具有某種活性的構象；（2）酶分子內(nèi)部修飾①酶蛋白質功能基團的可反應性；②修飾劑的可反應性。

SH-CH2-CH2OH二、化學修飾的機理2、蛋白質局部微區(qū)性質的影響功能基的反應性是通過它的親核性來顯示的，而親核性又常常與它的酸堿性有關，即與基團的pK有影響。微區(qū)的極性是決定基團解離狀態(tài)的關鍵因素之一。如：乙酸在水中的pK為4．76，在80％乙醇中增至6．87，在100％乙醇中增至10．32。乙酸羧基所處微區(qū)的極性直接與介質的介電常數(shù)有關。隨介質極性降低，羧基的pK升高。（1）微區(qū)的極性卵清溶菌酶中第35號谷氨酸的-C00H在25℃時的pK為5.9，而當溶菌酶與其抑制劑三-N-乙酰氨基葡萄糖結合后，此pK則升至6.4。pK的提高可能是由于這個殘基的微區(qū)極性降低之故?！?5

天然蛋白質通過氫鍵來維持其穩(wěn)定性，也是使pK發(fā)生改變的一個因素。例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。這是由于氟與酚基形成氫鍵的能力比溴強。水楊酸的羧基可與其酚基形成O--H…O氫鍵，結果使其羧基的pK比正常值小1，同時使酚基的正常pKl0改變到pKl3。（2）氫鍵效應不同蛋白質中的組氨酸殘基的pK是不同的。碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個組氨酸殘基。碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23；葡萄球菌核酸酶的pK是：5.37；5.71；5.74；6．50。組氨酸殘基在這兩個蛋白質中的pK范圍是5．37～7．23，pH幾乎相差2。這些變化可能是由于帶電基團相互影響所致。（3）靜電效應

處于蛋白質表面的功能基比較容易與修飾劑反應。如果烷基在空間上緊靠功能基，會使修飾劑不能與功能基接觸，這時就要出現(xiàn)位阻效應。如：對枯草桿菌蛋白酶BKN的所有的10個酪氨酸殘基均在蛋白質分子表面，而且其結構上的苯酚的羥基幾乎在所有情況下都沒有形成氫鍵。但是，如果對它進行徹底硝化和碘化后，10個酪氨酸中只有8個被修飾。（4）位阻效應①改變蛋白質功能基團的pK值；②蛋白質功能基團具有較大的親核性；③通過靜電相互作用吸引試劑，并使其有適當取向；④試劑與靠近修飾部位的蛋白質區(qū)域之間的立體化學適應性；超反應性由一個或幾個因素的綜合作用而產(chǎn)生。影響超反應性的因素：蛋白質的構象和表面特性對接近氨基酸側鏈功能基的修飾劑也產(chǎn)生有利或不利的影響。因而對修飾劑也提出了一定的要求。（三）修飾劑反應性的決定因素3、位阻因素；蛋白質表面的位阻因素或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應。4、催化因素；修飾部位附近的其他功能基，如果起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應。不同的修飾劑，其反應速度和反應部位有明顯差異。如對硝基苯乙酸鹽和苯乙酸鹽對胰凝乳蛋白酶的絲氨酸乙酰化機理相同，但后者反應性差。5、局部環(huán)境的極性：許多有機反應的速度與溶劑的極性有關，而有些反應則與極性無關。情況比較復雜。1、了解酶的性質

對酶的活性部位、酶的穩(wěn)定條件、酶反應最適條件及酶的側鏈基團等到的了解。三、設計酶化學修飾的要點2、選擇修飾劑的類型修飾劑的分子量、鏈的長度、對蛋白質的吸附性；修飾劑上反應基團的數(shù)量和位置；修飾劑上反應基團的活化方法與條件。一般要求修飾劑具有較大分子量、良好的生物相容性和水溶性、修飾劑分子表面有較多的反應活性基團及修飾后酶活的半衰期較長。3、選擇修飾反應的條件盡量少破壞酶活性功能的必需基團。反應體系中酶與修飾劑的分子比例；反應體系的溶劑性質、鹽濃度和pH條件；反應溫度及時間。四、常用的化學修飾劑①糖及糖的衍生物：主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝膠、聚乳糖等。②高分子多聚物：聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)聚乙烯(polyvinylalcohol，PVA)聚N-乙烯吡咯烷酮(poly（N-vinylpyrrolidone，PVP)聚順丁烯二酸酐、聚丙烯酸(polyacrylicacid，PAA)。

③生物大分子：常用的有肝素、血漿蛋白質、聚氨基酸類等。④雙功能試劑：主要有戊二醛、二異硫氰酸、二胺類等。⑤其他：常用的修飾劑還有某些固定化酶載體、糖基化試劑、甲基化試劑、乙基化試劑及某些小分子有機物等。酶的化學修飾基本原則：充分利用修飾劑所具有的各類化學基團的特性，直接或經(jīng)過一定的活化過程與酶分子中的某些基團或輔因子產(chǎn)生化學反應，對酶分子結構進行改造。五、化學修飾的措施酶分子中的可解離基團如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基等，都是可以被修飾的基團。1、修飾酶蛋白側鏈基團

（1）對巰基的修飾：烷化劑：如碘乙酸、碘乙酰胺、巰基乙醇、谷胱甘肽等。E-SH+ICH2COOH（或ICH2CONH2）→E-S-CH2COOH（或E-S-CH2CONH2）+HI（2）對氨基的修飾乙酸酐修飾：E-NH2+CH3COOCOCH3→E-NHCOCH3+CH3COOH修飾酶蛋白側鏈基團舉例（3）羧基的化學修飾ONR羰二亞胺反應：∥∥E-COO-+R-N=C=NHR`→E-C–O-C-NR`（4）咪唑基的修飾反應碘代反應：E-咪唑基+ICH2COO-→E-咪唑基-CH2COO-+HI（5）吲哚基的化學修飾4-硝基苯硫氯反應：E-吲哚基+CIS-苯環(huán)-NO2→E-吲哚基-S-苯環(huán)-NO2+HCL（6）二硫鍵的化學修飾2-巰基乙醇修飾：

SE+SH-CH2-CH2OH→SH-E-S-S-CH2-CH2OH

S酶蛋白側鏈經(jīng)修飾后，可以穩(wěn)定酶分子的催化活性，提高抗變性的能力。如超氧化物歧化酶(SOD)，作為藥物在體內(nèi)的半衰期僅為6～10min，影響其藥用效果。用聚乙二醇、右旋糖酐、聚蔗糖分別對SOD分子上的Lys的ε-NH2進行修飾后，所得到的修飾酶在血液中的半衰期可從原來的6-10min增加到幾小時，甚至達35h；應用某些雙功能交聯(lián)劑如戊二醛、聚乙二醇等可將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分進行共價交聯(lián)。如：用聚乙二醇修飾后的過氧化氫酶，抗蛋白水解酶的能力有明顯增加而且抗原性消失。2、酶分子內(nèi)或分子間進行交聯(lián)對于依賴輔因子的酶，可將輔因子共價結合在酶上或引入新的或修飾過的具有強反應性的輔因子；如：對于金屬酶中的金屬離子可以采取置換的辦法來改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。如羧肽酶A的活性部位中的鋅被鈷取代后，原有的酯酶活力和肽酶活力都增加；在淀粉酶中用鈣取代其他金屬離子也能使酶的穩(wěn)定性提高。

3、修飾酶的輔因子酶與某些蛋白質、多糖等高分子化合物結合后，可以增加其穩(wěn)定性。如α-淀粉酶在65℃時的半衰期僅為25min，用右旋糖酐修飾后，其半衰期可增加到63min。

4、酶與大分子化合物相結合肽鏈的一部分水解后有利于活性中心與底物結合并形成準確的催化部位。如用胰蛋白酶對天冬氨酸酶進行有限水解切去10個氨基酸后，酶的活力提高了5.5倍。說明天然酶并不總是處于最佳構象狀態(tài)。5、肽鏈的有限水解酶分子經(jīng)過化學修飾后，其特性在一定程度上發(fā)生改變，天然酶的一些不足之處可以得到改善。

六、修飾酶的特性1、熱穩(wěn)定性提高原因1

:修飾劑共價連接于酶分子后，使酶的天然構象產(chǎn)生一定的“剛性”，不易伸展失活，并減少了酶分子內(nèi)部基團的熱振動，從而增加了熱穩(wěn)定性。這種熱穩(wěn)定性效果和修飾劑與酶之間的交聯(lián)點的數(shù)目有關。（PEG和酶以單點交聯(lián)時熱穩(wěn)定性提高并不明顯，通常交聯(lián)點增多，酶的熱穩(wěn)定性就可提高）原因2:修飾劑本身增加了酶分子的表面親水性，使酶分子在水溶液中形成新的氫鍵和鹽橋。如α-胰凝乳蛋白酶的表面氨基經(jīng)乙醛酸修飾，再還原成親水性更強的-NHCH2COOH后，在60℃時熱穩(wěn)定性提高了1000倍，這種穩(wěn)定的酶可用于醫(yī)藥和洗滌工業(yè)。2、抗各類失活因子能力提高

某些酶修飾后抗蛋白水解酶水解、抗抑制劑、抗酸、堿、有機溶劑等變性失活能力明顯提高。原因1：修飾劑所產(chǎn)生的空間屏蔽有效地阻擋了水解酶、抑制劑等失活因子的進攻；原因2:酶分子中對蛋白水解酶等失活因子敏感的基團被修飾，因此使得某些修飾酶的抗失活因子能力提高。如:過氧化氫酶經(jīng)PEG修飾后，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明顯提高；尿激酶經(jīng)白蛋白修飾后，抗胃蛋白酶水解和抗胎盤抑制劑能力也分別增加。原因：酶分子結構上有一些氨基酸殘基組成了抗原決定簇，當酶作為異源蛋白進入機體后，就會誘發(fā)產(chǎn)生抗體，使酶失活；而化學修飾后，有些組成抗原決定簇的基團與修飾劑形成了共價鍵，可能破壞了酶分子上抗原決定簇的結構，降低抗原性。同時大分子修飾劑也同樣能“遮蓋”抗原決定簇和阻礙抗原、抗體產(chǎn)生結合反應。如：β-葡萄糖苷酶用白蛋白修飾后抗原性消除；

L-天門冬酰胺酶用PEG修飾后也消除了抗原性。

而糖類物質包括右旋糖酐也不容易消除酶的抗原性。

PEG、人血清白蛋白、聚丙氨酸在消除或降低酶抗原性上效果明顯。3、抗原性消除4、體內(nèi)半衰期延長許多酶經(jīng)過化學修飾后，由于增強了抗蛋白水解酶、抗抑制劑等失活因子的能力和熱穩(wěn)定性的提高，體內(nèi)半衰期比天然酶延長，這對提高藥用酶的療效很有意義。L-天門冬酰胺酶經(jīng)PEG修飾后，體內(nèi)半衰期延長13倍；白蛋白修飾的β-葡萄糖苷酶在體內(nèi)的半衰期延長18倍以上。

5、最適pH改變有些酶經(jīng)過化學修飾后，最適pH發(fā)生變化，這在生理和臨床應用上以及工業(yè)生產(chǎn)中更好地發(fā)揮酶的催化作用具有重要意義。6、酶學性質變化絕大多數(shù)酶經(jīng)過化學修飾后，最大反應速度Vm沒有變化。但有些酶在修飾后，米氏常數(shù)Km值會增大。化學修飾還可改變某些酶的底物專一性。如:脂肪酶經(jīng)過PEG修飾后，就可溶于有機溶劑,并能催化酯合成和酯交換等有機相反應，這將擴大酶在