第二章酶的生物合成法生產(chǎn)

酶的發(fā)酵生產(chǎn)根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同，可以分為固體培養(yǎng)發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固定化細胞發(fā)酵和固定化原生質(zhì)體發(fā)酵等?，F(xiàn)在是1頁\一共有89頁\編輯于星期四

固體培養(yǎng)發(fā)酵的培養(yǎng)基，以麩皮、米糠等為主要原料，加入其他必要的營養(yǎng)成分，制成固體或麩曲，經(jīng)過滅菌、冷卻后，接種產(chǎn)酶微生物菌株，在一定條件下進行發(fā)酵，以獲得所需的酶。我國傳統(tǒng)的各種酒曲、醬油曲等都是采用這種方式進行生產(chǎn)。其主要目的是獲得所需的淀粉酶類和蛋白酶類，以催化淀粉和蛋白質(zhì)的水解。固體培養(yǎng)發(fā)酵的優(yōu)點是設備簡單，操作方便，麩曲中酶的濃度較高，特別適用于各種霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶；其缺點是勞動強度較大，原料利用率較低，生產(chǎn)周期較長?，F(xiàn)在是2頁\一共有89頁\編輯于星期四液體深層發(fā)酵是采用液體培養(yǎng)基，置于生物反應器中，經(jīng)過滅菌、冷卻后，接種產(chǎn)酶細胞，在一定的條件下，進行發(fā)酵，生產(chǎn)得到所需的酶。液體深層發(fā)酵不僅適合于微生物細胞的發(fā)酵生產(chǎn)，也可以用于植物細胞和動物細胞的培養(yǎng)。液體深層發(fā)酵的機械化程度較高，技術管理較嚴格，酶的產(chǎn)率較高，質(zhì)量較穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率較高，是目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式。現(xiàn)在是3頁\一共有89頁\編輯于星期四

固定化細胞發(fā)酵是20世紀70年代后期，在固定化酶的基礎上發(fā)展起來的發(fā)酵技術。固定化細胞是指固定在水不溶性的載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞。固定化細胞發(fā)酵具有：細胞密度大，可提高產(chǎn)酶能力；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復使用或連續(xù)使用較長的時間；細胞固定在載體上，流失較少，可以在高稀釋率的條件下連續(xù)發(fā)酵，利于連續(xù)化、自動化生產(chǎn)；發(fā)酵液中含菌體較少，利于產(chǎn)品分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量等顯著特點。現(xiàn)在是4頁\一共有89頁\編輯于星期四

固定化原生質(zhì)體技術是20世紀80年代中期發(fā)展起來的技術。固定化原生質(zhì)體是指固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體由于去除了細胞壁這一擴散障礙，有利于胞內(nèi)物質(zhì)透過細胞膜分泌到細胞外。這樣就可以不經(jīng)過細胞破碎而直接從發(fā)酵液中分離得到所需的發(fā)酵產(chǎn)物，為胞內(nèi)物質(zhì)的生產(chǎn)開辟了新途徑。由于有載體的保護作用，固定化原生質(zhì)體有較好的穩(wěn)定性，可以反復使用或連續(xù)使用較長一段時間?，F(xiàn)在是5頁\一共有89頁\編輯于星期四現(xiàn)在是6頁\一共有89頁\編輯于星期四現(xiàn)在是7頁\一共有89頁\編輯于星期四現(xiàn)在是8頁\一共有89頁\編輯于星期四一、常用的產(chǎn)酶微生物用于酶的生產(chǎn)的細胞必須具備幾個條件①酶的產(chǎn)量高②容易培養(yǎng)和管理③產(chǎn)酶穩(wěn)定性好④利于酶的分離純化⑤安全可靠，無毒性現(xiàn)在是9頁\一共有89頁\編輯于星期四常用的產(chǎn)酶微生物

1．大腸桿菌(Escherichiacoli)現(xiàn)在是10頁\一共有89頁\編輯于星期四

大腸桿菌細胞有的呈桿狀，有的近似球狀，大小為0.5μm×(1.0～3.0)μm，一般無莢膜，無芽孢，革蘭氏染色陰性，運動或不運動，運動者周生鞭毛。菌落從白色到黃白色，光滑閃光，擴展。革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法,1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立細菌先經(jīng)堿性染料結晶染色,而經(jīng)碘液媒染后,用酒精脫色,在一定條件下有的細菌此色不被脫去,有的可被脫去,因此可把細菌分為兩大類,前者叫做革蘭氏陽性菌(G+)...

現(xiàn)在是11頁\一共有89頁\編輯于星期四大腸桿菌谷氨酸脫羧酶，用于測定谷氨酸含量或用于生產(chǎn)γ-氨基丁酸；大腸桿菌天冬氨酸酶，用于催化延胡索酸加氨生產(chǎn)L-天冬氨酸；大腸桿菌青霉素酰化酶，用于生產(chǎn)新的半合成青霉素或頭孢霉素；大腸桿菌天冬酰胺酶，對白血病具有顯著療效；大腸桿菌β-半乳糖苷酶，用于分解乳糖或其他β-半乳糖苷。現(xiàn)在是12頁\一共有89頁\編輯于星期四2．枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)枯草桿菌是芽孢桿菌屬細菌。細胞呈桿狀，大小為(0.7～0.8)μm×(2～3)μm，單個細胞，無莢膜，周生鞭毛，運動，革蘭氏染色陽性。芽孢(0.6～0.9)μm×(1.0～1.5)μm，橢圓至柱狀。菌落粗糙，不透明，不閃光，擴張，白色或微帶黃色。現(xiàn)在是13頁\一共有89頁\編輯于星期四

枯草芽孢桿菌是應用最廣泛的產(chǎn)酶微生物，可以用于生產(chǎn)a-淀粉酶，蛋白酶，β-葡聚糖酶，5’核苷酸酶，堿性磷酸酶等。例如，枯草桿菌BF7658是國內(nèi)用于生產(chǎn)a-淀粉酶的主要菌株；枯草桿菌ASl.398用于生產(chǎn)中性蛋白酶和堿性磷酸酶?，F(xiàn)在是14頁\一共有89頁\編輯于星期四3．黑曲霉(Aspergillusniger)

黑曲霉是曲霉屬黑曲霉群霉菌。菌絲體由具有橫膈的分支菌絲構成，菌叢黑褐色，頂囊大球形，小梗雙層，分生孢子球形，平滑或粗糙?，F(xiàn)在是15頁\一共有89頁\編輯于星期四黑曲酶可用于生產(chǎn)多種酶，有胞外酶也有胞內(nèi)酶。例如，糖化酶，a-淀粉酶，酸性蛋白酶，果膠酶，葡萄糖氧化酶，過氧化氫酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纖維素酶，橙皮苷酶，柚苷酶等?，F(xiàn)在是16頁\一共有89頁\編輯于星期四4．米曲酶(Aspergillusoryzae)米曲霉是曲霉屬黃曲霉群霉菌。菌叢一般為黃綠色，后變?yōu)辄S褐色，分生孢子頭呈放射形，頂囊球形或瓶形，小梗一般為單層，分生孢子球形，平滑，少數(shù)有刺，分生孢子梗長達2mm左右，粗糙。現(xiàn)在是17頁\一共有89頁\編輯于星期四

米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力較強，這使米曲霉在我國傳統(tǒng)的酒曲和醬油曲的制造中廣泛應用。此外，米曲霉還可以用于生產(chǎn)氨基?；浮⒘姿岫ッ浮⒐z酶、核酸酶P等。現(xiàn)在是18頁\一共有89頁\編輯于星期四5．青霉(Penicillium)

青霉屬半知菌綱。其營養(yǎng)菌絲體無色、淡色或具有鮮明的顏色，有橫膈，分生孢子梗亦有橫膈，光滑或粗糙，頂端形成帚狀分枝，小梗頂端串生分生孢子，分生孢子球形、橢圓形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生長時呈藍綠色。有少數(shù)種會產(chǎn)生閉囊殼，其內(nèi)形成子囊和子囊孢子，亦有少數(shù)菌種產(chǎn)生菌核?，F(xiàn)在是19頁\一共有89頁\編輯于星期四青霉菌種類很多，其中產(chǎn)黃青霉(Penzcilliumchrysogenum)用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶(主要作用于青霉素)、果膠酶、纖維素酶等。橘青霉(Penicilliumcityrinum)用于生產(chǎn)5，磷酸二酯酶、脂舫酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等?，F(xiàn)在是20頁\一共有89頁\編輯于星期四6．木霉(Trichoderma)

木霉屬于半知菌綱。生長時菌落生長迅速，呈棉絮狀或致密叢束狀，菌落表面呈不同程度的綠色，菌絲透明，有分隔，分枝繁復，分枝上可繼續(xù)分枝，形成二級分枝、三級分枝，分支末端為小梗，瓶狀，束生、對生、互生或單生，分生孢子由小梗相繼生出，靠黏液把他們聚成球形或近球形的孢子頭。分生孢子近球形、橢圓形、圓筒形或倒卵形。光滑或粗糙，透明或亮黃綠色。木霉是生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株。木霉生產(chǎn)的纖維素酶中包含有C1酶、Cx酶和纖維二糖酶等。此外，木霉中含有較強的17a-羥化酶，常用于甾體轉化。現(xiàn)在是21頁\一共有89頁\編輯于星期四

7．根霉(Rhizopus)生產(chǎn)糖化酶、a－淀粉酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等?，F(xiàn)在是22頁\一共有89頁\編輯于星期四8．毛霉(Mucor)

毛霉常用于生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、a－淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等?，F(xiàn)在是23頁\一共有89頁\編輯于星期四

9．紅曲霉紅曲霉可用于生產(chǎn)a-淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、蛋白酶等。

10．鏈霉菌鏈霉菌是生產(chǎn)葡萄糖異構酶的主要微生物。還可以用于生產(chǎn)青霉素?；?、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等。現(xiàn)在是24頁\一共有89頁\編輯于星期四二、發(fā)酵工藝條件及其控制微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝流程現(xiàn)在是25頁\一共有89頁\編輯于星期四保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須接種于新鮮的固體培養(yǎng)基上，在一定的條件下進行培養(yǎng)，使細胞的生命活性得以恢復，這個過程稱為細胞活化。活化了的細胞需在種子培養(yǎng)基中經(jīng)過一級乃至數(shù)級的擴大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細胞。種子擴大培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，應當適合細胞生長、繁殖的最適條件?，F(xiàn)在是26頁\一共有89頁\編輯于星期四(二)培養(yǎng)基的配制1．培養(yǎng)基的基本組分(1)碳源作用？如何選擇？在酶的生物合成法生產(chǎn)中，首先要從細胞的營養(yǎng)要求和代謝調(diào)節(jié)方面考慮碳源的選擇，此外還要考慮到原料的來源是否充裕、價格是否低廉、對發(fā)酵工藝條件和酶的分離純化有否影響等因素。

現(xiàn)在是27頁\一共有89頁\編輯于星期四A不同的細胞對碳源的利用有所不同，在配制培養(yǎng)基時，應當根據(jù)細胞的營養(yǎng)需要而選擇不同的碳源。目前，大多數(shù)產(chǎn)酶微生物采用淀粉或其水解產(chǎn)物，如糊精、淀粉水解糖、麥芽糖、葡萄糖等為碳源。例如，黑曲霉具有淀粉酶系，可以采用淀粉為碳源；酵母不能利用淀粉，只能采用蔗糖或葡萄糖等為碳源等。植物細胞主要采用蔗糖為碳源；具有葉綠體的植物和藻類可以利用二氧化碳為碳源等。B在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，除了根據(jù)細胞的不同營養(yǎng)要求以外，還要充分注意到某些碳源對酶的生物合成具有代謝調(diào)節(jié)的功能?，F(xiàn)在是28頁\一共有89頁\編輯于星期四(2)氮源作用？分類？氮源可以分為有機氮源和無機氮源兩大類。酪蛋白、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、蛋白水解液、多肽、氨基酸、氨水、硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉等銨鹽和硝酸鹽屬于什么氮源？選擇？動物細胞、植物細胞、微生物細胞？現(xiàn)在是29頁\一共有89頁\編輯于星期四(3)無機鹽作用無機鹽的主要作用是提供細胞生命活動所必不可缺的各種無機元素，并對細胞內(nèi)外的pH值、氧化還原電位和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。分類根據(jù)細胞對無機元素需要量的不同，無機元素可以分為大量元素和微量元素兩大類。大量元素主要有：磷、硫、鉀、鈉、鈣、鎂、氯等；微量元素是指細胞生命活動必不可少，但是需要量微小的元素，主要包括：銅、錳、鋅、鉬、鈷、溴、碘等。微量元素的需要量很少，過量反而對細胞的生命活動有不良影響，必須嚴加控制。現(xiàn)在是30頁\一共有89頁\編輯于星期四(4)生長因素生長因素是指細胞生長繁殖所必需的微量有機化合物，主要包括各種氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素以及動、植物生長激素等。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，一般在培養(yǎng)基中添加含有多種生長因素的天然原料的水解物，如酵母膏、玉米漿、麥芽汁、麩皮水解液等，以提供細胞所需的各種生長因素；也可以加入某種或某幾種提純的有機化合物，以滿足細胞生長繁殖之需。現(xiàn)在是31頁\一共有89頁\編輯于星期四2．微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的幾種發(fā)酵培養(yǎng)基(1)枯草桿菌BF7658a-酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉8％，豆餅粉4％，磷酸氫二鈉0.8%，氯化鈣0.2%，氯化銨0.15％(自然pH值)。（2）枯草桿菌AS1.398中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉4％，豆餅粉3％，麩皮3.2％，糠1％，磷酸氫二鈉0．4％，磷酸二氫鉀0.03％(自然pH值)。（3）黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10％，豆餅粉4％，麩皮1％(pH4.4～5.0)。(4)地衣芽孢桿菌2709堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5.5％，豆餅4％，磷酸氫二鈉0.4％，磷酸二氫鉀0.03％(pH8.5)?，F(xiàn)在是32頁\一共有89頁\編輯于星期四(三)pH值的調(diào)節(jié)控制

不同的細胞，其生長繁殖的最適pH值有所不同。細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值與生長最適pH值往往有所不同。有些細胞可以同時產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。隨著細胞的生長繁殖和新陳代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)基的pH值往往會發(fā)生變化。現(xiàn)在是33頁\一共有89頁\編輯于星期四在發(fā)酵過程中，必須對培養(yǎng)基的pH值進行適當?shù)目刂坪驼{(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)PH值的方法可以通過改變培養(yǎng)基的組分或其比例；也可以使用緩沖液來穩(wěn)定pH值；或者在必要時通過滴加適宜的酸、堿溶液的方法調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，以滿足細胞生長和產(chǎn)酶的要求。現(xiàn)在是34頁\一共有89頁\編輯于星期四(四)溫度的調(diào)節(jié)控制

不同的細胞有各自不同的最適生長溫度。例如，枯草桿菌的最適生長溫度為34～37℃，黑曲霉的最適生長溫度為28～32℃等。有些細胞發(fā)酵量的最適溫度與細胞生長最適溫度有所不同，而且往往低于生長最適溫度?，F(xiàn)在是35頁\一共有89頁\編輯于星期四

在細胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，由于細胞的新陳代謝作用，會不斷放出熱量，使培養(yǎng)基的溫度升高，同時，由于熱量的不斷擴散，會使培養(yǎng)基的溫度不斷降低。兩者綜合結果，決定了培養(yǎng)基的溫度。由于在細胞生長和產(chǎn)酶的不同階段，細胞新陳代謝放出的熱量有較大差別，散失的熱量又受到環(huán)境溫度等因素的影響，使培養(yǎng)基的溫度發(fā)生明顯的變化。為此必須經(jīng)常及時地對溫度進行調(diào)節(jié)控制，使培養(yǎng)基的溫度維持在適宣的范圍內(nèi)?，F(xiàn)在是36頁\一共有89頁\編輯于星期四溫度的調(diào)節(jié)一般采用熱水升溫、冷水降溫的方法。為了及時地進行溫度的調(diào)節(jié)控制，在發(fā)酵罐或其他生物反應器中，均應設有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等，并且隨時備有冷水和熱水，以滿足溫度調(diào)控的需要?，F(xiàn)在是37頁\一共有89頁\編輯于星期四(五)溶解氧的調(diào)節(jié)控制

調(diào)節(jié)溶解氧的方法主要有以下幾種。(1)調(diào)節(jié)通氣量(2)調(diào)節(jié)氧的分壓提高氧的分壓，可以增加氧的溶解度，從而提高溶氧速率。(3)調(diào)節(jié)氣液接觸時間(4)調(diào)節(jié)氣液接觸面積(5)改變培養(yǎng)液的性質(zhì)現(xiàn)在是38頁\一共有89頁\編輯于星期四(六)提高酶產(chǎn)量的措施1．添加誘導物誘導物一般可以分為3類：酶的作用底物、酶的催化反應產(chǎn)物和作用底物的類似物。2．控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)其作用機理的不同，可以分為產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。現(xiàn)在是39頁\一共有89頁\編輯于星期四控制阻遏物的濃度是解除阻遏、提高酶產(chǎn)量的有效措施。例如，作者等人研究表明，枯草桿菌堿性磷酸酶的生物合成受到其反應產(chǎn)物無機磷酸的阻遏，當培養(yǎng)基中無機磷酸的含量超過1.0mmol／L的時候，該霉的生物合成完全受到阻遏。當培養(yǎng)基中無機磷酸的含量降低到0.01mmol／L的時候，阻遏解除，該酶大量合成。所以，為了提高該酶的產(chǎn)量，必須限制培養(yǎng)基中無機磷的含量。現(xiàn)在是40頁\一共有89頁\編輯于星期四

3．添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。4．添加產(chǎn)酶促進劑產(chǎn)酶促進劑是指可以促進產(chǎn)酶、但是作用機理未闡明清楚的物質(zhì)。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，添加適宜的產(chǎn)酶促進劑，往往可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者橘青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1～20倍現(xiàn)在是41頁\一共有89頁\編輯于星期四(七)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶：實例

微生物發(fā)酵產(chǎn)酶是目前酶生產(chǎn)的主要方法。微生物種類繁多，產(chǎn)酶品種多樣。現(xiàn)以納豆桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶為例說明微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的基本條件和過程。納豆激酶(nattokinase，簡稱NK)是1987年日本的須見洋行從日本傳統(tǒng)食品納豆中分離得到的一種具有溶血栓功效的蛋白酶，可以通過枯草桿菌(Bacillussubtis)或納豆桿菌(Bacillusnatto)發(fā)酵得到。從1997年開始，郭勇等人進行了納豆桿菌發(fā)酵納豆激酶的研究，取得可喜成果?，F(xiàn)將發(fā)酵工藝過程介紹如下。現(xiàn)在是42頁\一共有89頁\編輯于星期四

菌株：納豆桿菌。固體培養(yǎng)基：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaC10.5％，瓊脂2%(自然pH值)。液體培養(yǎng)基：葡萄糖2％，大豆蛋白胨3％，磷酸氫二鈉0.6％，磷酸二氫鈉0.1%,氯化鈣0.02%，硫酸鎂0.05％(pH7.0)。工藝過程：保藏菌株——菌種活化(固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h)——種子培養(yǎng)(液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h)——發(fā)酵(液體培養(yǎng)基，接種量2～3％，37℃發(fā)酵72h)——發(fā)酵液——分離純化——納豆激酶?，F(xiàn)在是43頁\一共有89頁\編輯于星期四三、固定化微生物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶

固定化細胞又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞，是指采用各種方法固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進行生長、繁殖和新陳代謝的細胞。固定化細胞是20世紀70后期發(fā)展起來的技術。已成功生產(chǎn)了α-淀粉酶、糖化酶、果膠酶、纖維素酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等?，F(xiàn)在是44頁\一共有89頁\編輯于星期四（一）、固定化細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點1、提高產(chǎn)酶率2、可以反復使用或連續(xù)使用較長時間3、基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失4、發(fā)酵穩(wěn)定性好5、縮短發(fā)酵周期，提高設備利用率6、產(chǎn)品容易分離純化7、適于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)現(xiàn)在是45頁\一共有89頁\編輯于星期四（二）、固定化細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件控制

1、固定化細胞的預培養(yǎng)2、溶解氧的供給3、溫度的控制4、培養(yǎng)基組分的控制培養(yǎng)基的某些組分可能影響某些固定化載體的結構，為了保持固定化細胞的完整結構，應控制其含量。如采用海藻酸鈣凝膠制備的固定化細胞，培養(yǎng)基中過量的磷酸鹽會使其結構受到破壞，應限止，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的鈣離子，可以保持固定化細胞的穩(wěn)定性?，F(xiàn)在是46頁\一共有89頁\編輯于星期四四、固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶

固定化原生質(zhì)體是指固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體是除去細胞壁后由細胞膜及胞內(nèi)物質(zhì)組成的微球體。原生質(zhì)體由于除去了細胞壁這一擴散屏障，有利于胞內(nèi)物質(zhì)透過細胞膜分泌到細胞外，可以用于胞內(nèi)酶等胞內(nèi)產(chǎn)物的生產(chǎn)。現(xiàn)在是47頁\一共有89頁\編輯于星期四（一）、固定化原生質(zhì)體的特點

1、變胞內(nèi)產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物固定化黑曲霉原生質(zhì)體生產(chǎn)葡萄糖氧化酶，使細胞內(nèi)葡萄糖氧化酶的90％以上分泌到細胞外。2、提高產(chǎn)酶率固定化枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體生產(chǎn)堿性磷酸酶，使原來存在于細胞間質(zhì)中的堿性磷酸酶全部分泌到發(fā)酵液中，產(chǎn)酶率提高36％。3、穩(wěn)定性好4、易于分離純化現(xiàn)在是48頁\一共有89頁\編輯于星期四（二）、固定化原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件控制

1、滲透壓的控制添加滲透壓穩(wěn)定劑2、防止細胞壁再生添加青霉素等抑制細胞壁生長的物質(zhì)，以保持固定化原生質(zhì)體的特性3、保證原生質(zhì)體的濃度由于固定化原生質(zhì)體影響了細胞的生長繁殖，在制備時，應保證原生質(zhì)體的濃度達到一定的水平?，F(xiàn)在是49頁\一共有89頁\編輯于星期四細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/μm20～3001～1010～100倍增時間/h>120.3~0.6>15營養(yǎng)要求簡單簡單復雜光照要求大多要求不要求不要求對剪切力的敏感性敏感大多數(shù)不敏感敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精醇、氨基酸、抗生素、核苷酸、有機酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等現(xiàn)在是50頁\一共有89頁\編輯于星期四一、植物細胞的特性⑴體積大⑵生長速率和代謝速率比微生物低⑶營養(yǎng)要求簡單⑷要求一定的光照時間和光照強度⑸對剪切力敏感，這在生物反應器的研制和培養(yǎng)過程通風、攪拌方面要嚴加控制⑹目的產(chǎn)物不同現(xiàn)在是51頁\一共有89頁\編輯于星期四二、植物細胞培養(yǎng)的特點1、提高產(chǎn)率實例日本三井石油化學工業(yè)公司于1983年在世界上首次成功采用紫草細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧，750L反應器，培養(yǎng)23天，細胞中紫草寧的含量達到細胞干重的14％，比紫草根中紫草寧的含量高10倍。P68現(xiàn)在是52頁\一共有89頁\編輯于星期四紫草是我國傳統(tǒng)中草藥，其中的有效成分為一系列萘醌類化合物，具有涼血、活血、解毒和透疹的作用。用于子宮頸炎、外陰炎、尿布性皮炎、中耳炎、燙傷、刀傷、濕疹、水皰及其他皮膚病。紫草輔助米非司酮可提高流產(chǎn)成功率。具有抗垂體促性腺激素的作用，可以用于經(jīng)期綜合征，可以預防麻疹，有消腫作用，避孕作用。其中紫草寧具有抗腫瘤及活性，對Ｈｅｌａ細胞增殖有一定的抑制作用。減少自發(fā)性乳癌的發(fā)病率，對肝癌和Ｌｅｗｉｓ肺癌有一定的放射增敏作用。紫草寧可以提取紅色素，紫草油以及紫草可生產(chǎn)紫草ＳＯＤ等紫草系列保健品。可以作為如化妝品口紅、胭脂、粉餅、食品飲料、熏肉、醫(yī)藥膠囊、防曬制品及印染等著色劑和添加劑。

現(xiàn)在是53頁\一共有89頁\編輯于星期四

大規(guī)模細胞培養(yǎng)生物反應器

市場

前景及經(jīng)濟效益分析

:以年產(chǎn)能力50公斤紫草寧為例，國際市場價（精品干粉）每公斤價格為5000-7000美元，預計每年新增利稅25-35萬美元。除此之外，紫草寧因其色澤鮮艷，附著力強被國際譽為紅色素之王，可作為保健食品、保健飲品、保健化妝品的添加劑。

現(xiàn)在是54頁\一共有89頁\編輯于星期四2、縮短周期細胞培養(yǎng)倍增時間一般為12～60h，一般生產(chǎn)周期15～30d，與完整植株比較，大大縮短了生產(chǎn)周期。3、易于管理，減輕勞動強度4、提高產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)物濃度較高，雜質(zhì)少；污染少，易于分離純化。5、缺點與微生物相比，植物細胞對剪切力敏感，生產(chǎn)周期長，需光照。這些會在植物細胞生物反應器的設計和工藝條件控制等方面引起一系列的問題，必須考慮和解決。現(xiàn)在是55頁\一共有89頁\編輯于星期四三、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝條件及其控制（一）、工藝流程外植體------誘導愈傷組織-------細胞培養(yǎng)--------分離純化--------酶現(xiàn)在是56頁\一共有89頁\編輯于星期四（二）、植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基1、植物細胞培養(yǎng)基的特點觀察思考P70植物細胞培養(yǎng)基的特點？現(xiàn)在是57頁\一共有89頁\編輯于星期四植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例

據(jù)報道，已經(jīng)研究過200多種植物細胞培養(yǎng)，其產(chǎn)物超過400中。其中通過植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的酶有10多種，如表所示。現(xiàn)在是58頁\一共有89頁\編輯于星期四酶產(chǎn)酶植物細胞（年份）糖苷酶過氧化物酶糖化酶木瓜蛋白酶超氧化物岐化酶菠蘿蛋白酶胡蘿卜細胞（1981）甜菜細胞1983，大豆細胞1989甜菜細胞1988番木瓜細胞1990大蒜細胞1993菠蘿細胞1995現(xiàn)在是59頁\一共有89頁\編輯于星期四閱讀大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)SOD實例，說明植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶工藝過程及調(diào)節(jié)控制?，F(xiàn)在是60頁\一共有89頁\編輯于星期四SOD是催化超氧負離子進行氧化還原反應的氧化還原酶，具有抗輻射、抗氧化、抗衰老的功效。SOD可以從動物、植物和微生物細胞中提取分離得到。郭勇教授從1992年開始進行大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物岐化酶的研究取得可喜成果。工藝過程簡介如下?，F(xiàn)在是61頁\一共有89頁\編輯于星期四1、大蒜愈傷組織的誘導選取結實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，在4℃冰箱中放置3周，以打破休眠。去除外皮，先用70％乙醇消毒20s，再用0.1％氯化汞消毒10min，再用無菌水漂洗3次。在無菌條件下，切成0.5cm的小塊，植入含有3mg/L2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L6-BA(芐基酰嘌呤)的半固體MS培養(yǎng)基中，25℃，600lux,12h/d光照的條件下培養(yǎng)18d，誘導得到愈傷組織。現(xiàn)在是62頁\一共有89頁\編輯于星期四光照度與勒克斯：

光照度是表明物體被照明程度的物理量。光照度與照明光源、被照表面及光源在空間的位置有關，大小與光源的光強和光線的入射角的余玄成正比，而與光源至被照物體表面的距離的平方成反比。光照度可用照度計直接測量。光照度的單位是勒克斯，英文lux的音譯，也可寫為lx。被光均勻照射的物體，在1平方米面積上所得的光通量是1流明時，它的照度是1勒克斯。有時為了充分利用光源，常在光源上附加一個反射裝置，使得某些方向能夠得到比較多的光通量，以增加這一方向被照面上的照度。例如攝像、攝影照明燈、手電筒和汽車前燈等都裝有反光鏡。

現(xiàn)在是63頁\一共有89頁\編輯于星期四以下是各種環(huán)境照度值：單位lux

黑夜0.001-0.02

月夜0.02-0.3

陰天室內(nèi)5-50

陰天室外50-500

晴天室內(nèi)100-1000

夏季中午太陽光下的照度約為109

閱讀書刊時所需的照度50-60

電視演播室所需照度300–2000

家用攝像機所需最小照度0.3-1

家用攝像機標準照度1400現(xiàn)在是64頁\一共有89頁\編輯于星期四2、大蒜細胞懸浮培養(yǎng)將上述在半固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d的愈傷組織在無菌條件下轉入含有3mg/L2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L6-BA(芐基酰嘌呤)的液體培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，25℃，600lux,12h/d光照的條件下震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)18d，使愈傷組織分散成小細胞團或單細胞?，F(xiàn)在是65頁\一共有89頁\編輯于星期四然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細胞團或單細胞轉入含有3mg/L2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L6-BA(芐基酰嘌呤)的液體MS培養(yǎng)基中，25℃，600lux,12h/d光照的條件下培養(yǎng)18d。3、酶的分離純化4、細胞培養(yǎng)完成后，收集細胞，經(jīng)過細胞破碎、提取、分離得到超氧化物岐化酶。現(xiàn)在是66頁\一共有89頁\編輯于星期四第三節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶所謂動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術（large-scaleculturetechnology）是指在人工條件下（設定ph、溫度、溶氧等），在細胞生物反應器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產(chǎn)生物制品的技術。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及人二倍體細胞、cho（中華倉鼠卵巢）細胞、BHK-21(倉鼠腎細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞，是貼壁依賴的成纖維細胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。

現(xiàn)在是67頁\一共有89頁\編輯于星期四

目前已實現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細胞病毒疫苗、α及β干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。其中，口蹄疫疫苗是動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。1983年，英國Wellcome公司就已能夠利用動物細胞進行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗?，F(xiàn)在是68頁\一共有89頁\編輯于星期四美國Genentech公司應用SV40為載體，將乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳動物細胞內(nèi)進行高效表達，已生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。英國Wellcome公司采用8000LNamalwa細胞生產(chǎn)α干擾素。英國Celltech公司用氣升式生物反應器生α、β和γ干擾素；用無血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反應器中培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。美國Endotronic公司用中空纖維生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長激素等?，F(xiàn)在是69頁\一共有89頁\編輯于星期四動物細胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)：疫苗、激素、多肽生長因子、酶、單克隆抗體、非抗體免疫調(diào)節(jié)劑。白介素與機體免疫功能有關，白介素-2促進淋巴細胞分化增殖。乙型肝炎疫苗，預防乙肝。集落刺激因子，可減輕化療時副作用，可用于愛滋病、白血病。腫瘤壞死因子，可損傷癌細胞。研制更新一代的藥物和更新的應用方法，集落刺激因子和白介素的基因構建到酵母細胞中，使之產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)，藥效增強。生產(chǎn)方法從利用重組DNA的微生物生產(chǎn)轉向利用動植物來生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物，構建新型多價活疫苗。現(xiàn)在是70頁\一共有89頁\編輯于星期四一、動物細胞的特性

⑴沒有細胞壁，適應環(huán)境的能力差，脆弱⑵體積比微生物大幾千倍，但是稍小于植物細胞的體積。⑶在機體內(nèi)相互粘連以集群形式形式存在，在細胞培養(yǎng)中大部分細胞具有群體效應、錨地依賴型、接觸抑制性以及功能全能性。⑷動物細胞的營養(yǎng)要求較復雜，必須供給各種氨基酸、維生素、激素和生長因子等。動物細胞培養(yǎng)基中一般需要加進5％－10％的血清?，F(xiàn)在是71頁\一共有89頁\編輯于星期四二、動物細胞培養(yǎng)的特點

⑴動物細胞培養(yǎng)主要用于各種功能蛋白質(zhì)的生產(chǎn)⑵生長較慢，細胞倍增時間15－100h⑶為防止微生物污染，在培養(yǎng)過程中，需要添加抗生素。⑷動物細胞體積大，無細胞壁保護，對剪切力敏感，所有在培養(yǎng)過程中，必須嚴格控制溫度、PH、滲透壓、通風攪拌等條件，以免破壞細胞⑸大多數(shù)細胞適宜采用貼壁培養(yǎng)，來自血液、淋巴組織的細胞、腫瘤細胞和雜交瘤細胞可以采用懸浮培養(yǎng)。⑹動物細胞培養(yǎng)基成分復雜，一般要添加血清或其代用品，產(chǎn)物的分離純化過程較復雜，成本高⑺原代細胞培養(yǎng)50代后，即會退化死亡，需要重新分離細胞。現(xiàn)在是72頁\一共有89頁\編輯于星期四三、動物細胞培養(yǎng)方式

細胞具有四大生物學特征：錨地依賴性：細胞必須附在固體上或固定的表面，才能生長分裂。血清依賴性：細胞必須具有生長因子，才能生長。接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生長便受到抑制。形態(tài)依賴性：細胞稱扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結構?，F(xiàn)在是73頁\一共有89頁\編輯于星期四依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質(zhì)依賴性差異，動物細胞可分為兩類：

●貼壁依賴型細胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數(shù)動物細胞，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬于這一類。

●非貼壁依賴型細胞：無需附著于固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細胞、許多腫瘤細胞及某些轉化細胞?，F(xiàn)在是74頁\一共有89頁\編輯于星期四1、懸浮培養(yǎng)

是指細胞在反應器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細胞培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等；是在微生物發(fā)酵的基礎上發(fā)通起來的。

無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。現(xiàn)在是75頁\一共有89頁\編輯于星期四2、貼壁培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)（attachmentculture）是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養(yǎng)。

⑴.生長特性：貼壁依賴型細胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細胞單層。

現(xiàn)在是76頁\一共有89頁\編輯于星期四⑵.貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：

●容易更換培養(yǎng)液；細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

●容易采用灌注培養(yǎng)，從而達到提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。

●當細胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細胞將更有效的表達一種產(chǎn)品。

●同一設備可采用不同的培養(yǎng)液/細胞的比例。

●適用于所有類型細胞。

現(xiàn)在是77頁\一共有89頁\編輯于星期四⑶.貼壁培養(yǎng)的缺點：與懸浮培養(yǎng)法相比

●擴大培養(yǎng)比較困難，投資大；

●占地面積大；

●不能有效監(jiān)測細胞的生長；

現(xiàn)在是78頁\一共有89頁\編輯于星期四動物細胞培養(yǎng)反應器現(xiàn)在是79頁\一共有89頁\編輯于星期四現(xiàn)在是80頁\一共有89頁\編輯于星期四動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝條件及其控制

（一）、動物細胞培養(yǎng)基的組成成分無機鹽：CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4。對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。現(xiàn)在是81頁\一共有89頁\編輯于星期四維生素：是維持細胞生長的一種生物活性物質(zhì)，在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B1