第三章細胞生物學研究方法(4學時)

細胞生物學研究方法進行初步觀察形成可驗證的假說設計試驗收集資料解釋結果作出合理結論查閱已有知識生物學研究模式生物是基于不同物種享有共同分子機制現在是1頁\一共有46頁\編輯于星期四CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana現在是2頁\一共有46頁\編輯于星期四第三章細胞生物學研究方法第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法第二節(jié)細胞組分的分析方法第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術現在是3頁\一共有46頁\編輯于星期四第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法

1光學顯微鏡技術（lightmicroscopy）

2

電子顯微鏡技術

(Electromicroscopy)3掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)現在是4頁\一共有46頁\編輯于星期四一、光學顯微鏡技術（lightmicroscopy)

普通復式光學顯微鏡技術

熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術（LaserScanningConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）（自習）現在是5頁\一共有46頁\編輯于星期四普通復式光學顯微鏡技術

分辨率是指區(qū)分開兩個質點間的最小距離現在是6頁\一共有46頁\編輯于星期四普通光學顯微鏡現在是7頁\一共有46頁\編輯于星期四各種顯微鏡的分辨率梯度現在是8頁\一共有46頁\編輯于星期四熒光顯微鏡技術

（FluorescenceMicroscopy）原理現在是9頁\一共有46頁\編輯于星期四熒光顯微鏡技術

（FluorescenceMicroscopy）應用

直接熒光標記技術

間接熒光標記技術(免疫熒光標記技術)

用于特異蛋白質等生物大分子的定性定位：如綠色熒光蛋白(GFP)的應用

現在是10頁\一共有46頁\編輯于星期四應用：綠色熒光蛋白現在是11頁\一共有46頁\編輯于星期四激光共焦掃描顯微鏡技術

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理：應用： 排除焦平面以外光的干擾，增強 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，通過“光切片”觀察樣品內部結構，可重構樣品的三維結構?，F在是12頁\一共有46頁\編輯于星期四激光共焦掃描顯微系統(Confocal

System)現在是13頁\一共有46頁\編輯于星期四PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUniversityCytometryLaboratories

利用光切片技術顯示的花粉內部結構現在是14頁\一共有46頁\編輯于星期四1為轉GFP基因的煙草單細胞；2為轉SCaM1-GFP融合基因的煙草單細胞；3為轉SCaM4-GFP融合基因的煙草單細胞。

質壁分離后轉基因煙草單細胞的激光共聚焦顯微鏡觀察細胞壁細胞膜細胞核細胞壁細胞壁細胞膜細胞核細胞膜細胞核細胞核細胞膜細胞壁細胞核細胞膜現在是15頁\一共有46頁\編輯于星期四二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較

電子顯微鏡的基本構造

現在是16頁\一共有46頁\編輯于星期四電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差現在是17頁\一共有46頁\編輯于星期四電子顯微鏡的基本構造電子束照明系統、成像系統、真空系統、記錄系統現在是18頁\一共有46頁\編輯于星期四二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較

電子顯微鏡的基本構造

主要電鏡制樣技術

負染色技術冰凍蝕刻技術超薄切片技術電鏡三維重構技術

現在是19頁\一共有46頁\編輯于星期四主要電鏡制樣技術超薄切片技術用于電鏡觀察的樣本制備示意圖細胞超微結構

負染色技術（Negativestaining）

染色背景，襯托出樣品的精細結構，如病毒、核糖體等結構。

冷凍蝕刻技術（Freezeetching）

冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質顆粒和膜表面結構。

電鏡三維重構技術

電鏡三維重構技術與X-射線晶體衍射技術及核磁共振分析技術相結合，是當前結構生物學（StructuralBiology）

主要研究生物大分子空間結構及其相互關系的主要實驗手段。

現在是20頁\一共有46頁\編輯于星期四固定

包埋切片染色超薄切片技術現在是21頁\一共有46頁\編輯于星期四超薄切片技術圖片示例現在是22頁\一共有46頁\編輯于星期四冷凍蝕刻現在是23頁\一共有46頁\編輯于星期四二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構造

主要電鏡制樣技術

負染色技術冰凍蝕刻技術超薄切片技術電鏡三維重構技術

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

現在是24頁\一共有46頁\編輯于星期四掃描電鏡原理與應用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。

CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題現在是25頁\一共有46頁\編輯于星期四現在是26頁\一共有46頁\編輯于星期四三、掃描遂道顯微鏡ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結構的儀器。反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。特點：分辨率高：

側分辨率：分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達0.001nm不受介質限制非破壞性

用途：納米生物學研究領域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結構，觀察生物大分子、膜、病毒等的結構。現在是27頁\一共有46頁\編輯于星期四

2.特異蛋白抗原的定位與定性

3.細胞內特異核酸的定位與定性

4.放射自顯影技術

1.離心分離技術第二節(jié)細胞組分的分析方法現在是28頁\一共有46頁\編輯于星期四一、離心分離技術

用途：分離細胞器與生物大分子及其復合物

差速離心：分離密度不同的細胞組分

密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離現在是29頁\一共有46頁\編輯于星期四差速離心現在是30頁\一共有46頁\編輯于星期四密度梯度離心常用的介質：蔗糖、氯化銫、甘油等?，F在是31頁\一共有46頁\編輯于星期四二、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術免疫膠體金技術應用：能對蛋白進行精細定位。如通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(Western-Blot)現在是32頁\一共有46頁\編輯于星期四免疫熒光技術圖片示例現在是33頁\一共有46頁\編輯于星期四免疫膠體金技術原理與圖片示例現在是34頁\一共有46頁\編輯于星期四三、細胞內特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術

（同位素標記或熒光素標記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術

（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結合）

現在是35頁\一共有46頁\編輯于星期四四、放射自顯影技術原理及應用：利用同位素的放射自顯影，對細胞內生物大分子進行定性、定位與半定量研究；實現對細胞內生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。

現在是36頁\一共有46頁\編輯于星期四現在是37頁\一共有46頁\編輯于星期四第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程

1細胞的培養(yǎng)2細胞工程與顯微操作技術現在是38頁\一共有46頁\編輯于星期四一、細胞的培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng) 類型：原代培養(yǎng)細胞（primaryculturecell） 傳代培養(yǎng)細胞（sub-culturecell）

細胞株（cellstrain）正常二倍體，具有接觸抑制。

細胞系（cellline）染色體改變，接觸抑制喪失，無限傳代植物細胞培養(yǎng)非細胞體系（cell-freesystem）

研究DNA復制、蛋白質合成等生命活動現在是39頁\一共有46頁\編輯于星期四現在是40頁\一共有46頁\編輯于星期四Hela細胞（左）、CHO細胞（右）的培養(yǎng)現在是41頁\一共有46頁\編輯于星期四二、細胞工程細胞融合（cellfusion）與細胞雜交（cellhybridization）技術單克隆抗體技術細胞拆合與顯微鏡操作技術轉基因動物與轉基因植物

現