生物化學(xué)簡明教程第二章蛋白質(zhì)課件

第二章蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)主要元素組成：C、H、O、N、S及P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se等微量元素。

蛋白質(zhì)平均含N量為16％,這是凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)：

蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)含N量×6.25

第一節(jié)蛋白質(zhì)的分類一、根據(jù)分子形狀分類二、根據(jù)分子組成分類單純蛋白質(zhì)（如清蛋白等）結(jié)合蛋白質(zhì)（如核蛋白等）第二節(jié)蛋白質(zhì)的組成單位-氨基酸一、氨基酸的結(jié)構(gòu)1、結(jié)構(gòu)通式

CCOOHHNH2

R2、構(gòu)型：L型、D型二、氨基酸的分類1、按R基的極性不同來分類非極性R基氨基酸含脂肪烴R基：Gly、Val、Ala

Leu、Ile、

含芳香環(huán)及雜環(huán)R基：Phe、Trp、Pro極性R基氨基酸不帶電荷的極性R基：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys帶正電荷的極性R基：Lys、His、

Arg帶負(fù)電荷的極性R基：Asp、Glu三、氨基酸的理化性質(zhì)1、一般物理性質(zhì)2、化學(xué)性質(zhì)（1）氨基參加的反應(yīng)與亞硝酸的反應(yīng)與甲醛的反應(yīng)與2，4-二硝基氟苯的反應(yīng)與異硫氰酸苯酯的反應(yīng)（2）羧基參加的反應(yīng)成鹽和成脂反應(yīng)脫羧反應(yīng)（3）氨基和羧基共同參加的反應(yīng)兩性解離（兩性離子、兩性解離、等電點）茚三酮反應(yīng)成肽反應(yīng)（4）由側(cè)鏈基團(tuán)參加的反應(yīng)雙縮尿反應(yīng)黃蛋白反應(yīng)乙醛酸反應(yīng)坂口反應(yīng)酚試劑反應(yīng)米倫氏反應(yīng)第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（一）、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（二）、空間結(jié)構(gòu)包含的內(nèi)容1、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（1）、定義定義舉例：胰島素的一級結(jié)構(gòu)（2）、包含內(nèi)容α-螺旋結(jié)構(gòu)β-折疊結(jié)構(gòu)β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（3）、超二級結(jié)構(gòu)：αα、βαβ、βββ、β曲折（4）、結(jié)構(gòu)域2、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)舉例：鯨肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)3、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)舉例：血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)（亞基）三、維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵1、共價鍵：肽鍵、二硫鍵2、非共價鍵：氫鍵、范德華力、

鹽鍵（離子鍵）、疏水鍵第六節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)1、蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量

沉降系數(shù)S2、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點

等電點isoelectricpoint：蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷和負(fù)電荷相等時溶液的pH值。

pI在有中性鹽時有明顯變化，因分子中某些解離基團(tuán)可與鹽的離子如Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO42-結(jié)合，觀察到的pI在一定程度上決定于介質(zhì)中離子的組成。pI是蛋白質(zhì)的一個特征常數(shù)。不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點等電點是蛋白質(zhì)的一個特征常數(shù)，其等電點是由可解離基團(tuán)的種類和數(shù)目決定的，而這在不同的蛋白質(zhì)中是不同的。不同蛋白質(zhì)的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基的多少，直接影響蛋白質(zhì)等電點的大小。蛋白質(zhì)在等電點時的溶解度最小，因此不同蛋白質(zhì)的等電點不同來沉淀不同的蛋白質(zhì)，分離蛋白質(zhì)混合物。氨基酸的甲醛滴定

*反應(yīng)特點A.為α-NH2的反應(yīng)B.在常溫，中性條件，甲醛與α-NH2很快反應(yīng)，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。*應(yīng)用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（間接滴定）A.直接滴定，終點pH過高（12），沒有適當(dāng)指示劑。B.與甲醛反應(yīng)，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。C.釋放一個氫離子，相當(dāng)于一個氨基（摩爾比1：1）D.簡單快速，一般用于測定蛋白質(zhì)的水解速度。

Edman（苯異硫氰酸酯法）：由Edman于1950年首先提出，為α-NH2的反應(yīng)，用于N末端分析，又稱Edman降解法。此法的特點是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng)

*反應(yīng)特點A.為α-NH2的反應(yīng)B.氨基酸α-NH2的一個H原子可被烴基取代(鹵代烴)C.在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成二硝基苯氨基酸與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)

*應(yīng)用：鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸首先由Sanger應(yīng)用，確定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)A.肽分子與DNFB反應(yīng)，得DNP-肽B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游離氨基酸C.分離DNP-氨基酸D.層析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的種類、數(shù)目Corey&Pauling特征：1、每隔3.6個AA殘基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;2、螺旋體中所有氨基酸殘基R側(cè)鏈都伸向外側(cè)，鏈中的全部>C=0和>N-H幾乎都平行于螺旋軸;3、每個氨基酸殘基的>N-H與前面第四個氨基酸殘基的>C=0形成氫鍵，肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成。

α－螺旋（α－h(huán)elix）形成因素：與ＡＡ組成和排列順序直接相關(guān)。多態(tài)性：多數(shù)為右手（較穩(wěn)定），亦有少數(shù)左手螺旋存在（不穩(wěn)定）；存在尺寸不同的螺旋。*影響α-螺旋形成的因素

氨基酸組成和序列？R基團(tuán)？脯氨酸？

-折疊

①定義：兩條或幾條幾乎完全伸展的多肽鏈側(cè)向聚集在一起，相鄰肽鏈主鏈上的氨基和羰基之間形成有規(guī)則的氫鍵，維持這種片層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。②特點：多肽鏈主鏈比較伸展，相鄰aa的軸心距為0.35nm，側(cè)鏈R交替分布在片層平面的上、下方。有平行和反平行兩面種幾乎所有的肽鍵都參與了鏈間氫鍵的形成肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)肌紅蛋白（myoglobin）分子由一條多肽鏈（153個殘基）和一個血紅素組成。分子呈扁圓形，大小為4.5nm×3.5nm×2.5nm。多肽鏈主鏈骨架包含長短不等的A、B、C、D、E、F、G、H共8個α-螺旋。分子中幾乎80％的氨基酸殘基都是位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中。α-螺旋之間的拐彎處（AB、CD、EF、FG、GH）是無規(guī)卷曲。絕大多數(shù)親水性R側(cè)鏈分布在分子的外表面，與水分子結(jié)合，使肌紅蛋白可溶于水溶液中。絕大多數(shù)疏水性R側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部。

分子表面有一個深陷的洞穴。該洞穴由C、E、F、G共4個螺旋段構(gòu)成。洞穴周圍分布許多疏水性R側(cè)鏈，從而為洞穴構(gòu)成了疏水性環(huán)境。平面的血紅素分子埋人疏水的洞穴中。維持肌紅蛋白分子二級結(jié)構(gòu)的力是范德華引力、疏水鍵、氫鍵和配位鍵。血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)：氫鍵維系蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵

a鹽鍵（離子鍵）b氫鍵c疏水相互作用力

d范德華力e二硫鍵f酯鍵甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）纈氨酸（Val,V）亮氨酸（Lue,L）異亮氨酸（Ile,I）中性脂肪族氨基酸含羥基或硫脂肪族氨基酸絲氨酸（Ser,S）蘇氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）堿性氨基酸

賴氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）組氨酸（His,H）雜環(huán)雜環(huán)氨基酸

組氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trg,W）氨基酸的兼性離子形式：氨基酸或肽在晶體或水中以兼性離子形式存在，熔點高。為什么？氨基酸的兩性解離

pH=pI凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3++H++

OH-+H++

OH-(pK′1)(pK′2)pH=pI：蛋白質(zhì)處于中性環(huán)境，兩邊解離趨勢相等而成兼性離子pH＞pI：蛋白質(zhì)處于堿性環(huán)境，羧基解離趨勢大于氨基而成負(fù)離子pH＜pI：蛋白質(zhì)處于酸性環(huán)境，氨基解離趨勢大于羧基而成正離子氨基酸的等電點

當(dāng)氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelectricpoint，pI)。*在氨基酸等電點以上任何pH，AA帶凈的負(fù)電荷，在電場中向陽極移動；在氨基酸等電點以下任何pH，AA帶凈的正電荷，在電場中向陰極移動。*在一定pH范圍中，溶液的pH離AA等電點愈遠(yuǎn)，AA帶凈電荷愈多。

氨基酸等電點的計算

可見，氨基酸的pI值等于該氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團(tuán)pK′值之和的二分之一。pI=2pK1+pK2一氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK2+pKRNH2二氨基一羧基AA的等電點計算：pI=2pK1+pKRCOOH一氨基二羧基AA的等電點計算：

蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)和等電點

pH=pI凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點（isoelectricpoint，pI）。

β－轉(zhuǎn)角（β-turn）

特征：多肽鏈中氨基酸殘基n的羰基上的氧與殘基（n+3）的氮原上的氫之間形成氫鍵，肽鍵回折1800。

五、蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

(2)結(jié)構(gòu)域（structuredomain）

蛋白質(zhì)中相鄰的二級結(jié)構(gòu)單位（即單個α－螺旋或β－折疊或β－轉(zhuǎn)角）組合在一起，形成有規(guī)則的、在空間上能辯認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體稱為蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)

基本組合方式：αα；β×β；βββ

在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽進(jìn)一步卷曲折疊成幾個相對獨立、近似球形的三維實體，再由兩個或兩個以上這樣的三維實體締合成三級結(jié)構(gòu)，這種相對獨立的三維實體稱為結(jié)構(gòu)域。

形成意義：

動力學(xué)上更為合理

蛋白質(zhì)（酶）活性部位往往位于結(jié)構(gòu)域之間，使其更具柔性(１)超二級結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure

）卵溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)中的兩個結(jié)構(gòu)域-螺旋-轉(zhuǎn)角-折疊二硫鍵結(jié)構(gòu)域1結(jié)構(gòu)域2a-氨基可與亞硝酸反應(yīng)產(chǎn)生氮氣一級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域

supersecondarystructureStructuredoman

第四節(jié)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)氫鍵（hydrogenbond）主要維持蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)，對三、四級結(jié)構(gòu)亦有一定作用。范德華引力（Vanderwealsforce）實質(zhì)是靜電引力，維持三、四級結(jié)構(gòu)。包括：①二個極性基團(tuán)偶極之間的靜電吸引（取向力）；②極性基團(tuán)的偶極與非極性基團(tuán)的誘導(dǎo)偶極之間的靜電吸引（誘導(dǎo)力）；③二個非極性基團(tuán)瞬時偶極之間的靜電吸引（色散力）。疏水作用力（hydrophobicbond）2個或2個以上的疏水基團(tuán)（非極性基團(tuán)）因極性水分子的排斥而接近，因范德華引力而結(jié)合，這種結(jié)合力稱疏水作用力或疏水鍵。主要維持三、四級結(jié)構(gòu)。

離子鍵（ionicbond）正負(fù)離子之間的靜電吸引產(chǎn)生的化學(xué)鍵。在一些蛋白質(zhì)分子中，離子鍵參與維持三、四級結(jié)構(gòu)。。

二硫鍵（disulfidebond）指二個硫原子之間的共價鍵，又稱二硫橋、硫硫橋。在一些蛋白質(zhì)中，二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子構(gòu)象起重要的作用。患者的Hb量僅為正常人（15~16g/100m1）的一半，紅細(xì)胞數(shù)目是正常人[(4.6~6.2)×106個/ml]的一半左右，且形態(tài)不正常，除有大量的未成熟紅細(xì)胞外，還有很多長而薄、新月狀或鐮刀狀的紅細(xì)胞。當(dāng)紅細(xì)胞脫氧時，這種鐮刀狀細(xì)胞明顯增加。純合子（50%紅細(xì)胞鐮刀狀化）多在童年死去，無后代；雜合子患者（1％的患者紅細(xì)胞鐮刀狀化）的壽命也短，但能抵抗流行于非洲的致死性瘧疾（malaria），會有后代。正常紅細(xì)胞與鐮刀形紅細(xì)胞的掃描電鏡圖鐮刀形紅細(xì)胞正常紅細(xì)胞

氨基酸序列的細(xì)微變化正常的血紅蛋白Hb和異常的血紅蛋白HbS僅在β鏈的第6個氨基酸有Glu變?yōu)榱薞al，電泳時向正極的移動速度HbS比HbA稍慢。人類發(fā)現(xiàn)的300多種血紅蛋白變體，絕大多數(shù)只有一個氨基酸差異，因為取代的位置不同，對功能的影響程度有差異，但目前對取代氨基酸影響功能的了解很少。-鏈N端氨基酸排列順序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…

Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…鐮刀狀細(xì)胞血紅蛋白的治療性矯正

體外用氰酸鉀處理患者的紅細(xì)胞，可防止在去氧時形成鐮刀狀，輸氧能力有好轉(zhuǎn)。

蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)和等電點

pH=pI凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點（isoelectricpoint，pI）。

Thethermaldenaturation

ofribonuclease

變性是一個協(xié)同過程：在很窄的變性劑濃度范圍，很窄PH或溫度。（2）、引起蛋白質(zhì)變性的因素有：①.物理因素?zé)幔?0~100℃）、紫外線、X射線、超聲波、高壓、表面張力，以及劇烈的振蕩、研磨、攪拌等；②.化學(xué)因素化學(xué)因素又稱為變性劑，包括：酸、堿、有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮等）、尿素、鹽酸胍、重金屬鹽、三氯醋酸、苦味酸、磷鎢酸以及去污劑等。（3)、變性表現(xiàn)及變性機(jī)理①.生物功能喪失；②.物理性質(zhì)發(fā)生改變；③.化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變；④.側(cè)鏈基團(tuán)暴露(4)、復(fù)性復(fù)性：蛋白質(zhì)的變性作用如果不過于劇烈，則是一種可逆過程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象成為復(fù)性（renaturation）。如1條肽鏈、4個二硫鍵的RNA酶，被8mol/L尿素和巰基乙醇變性，二硫鍵全部斷裂，酶活性和結(jié)晶能力全部喪失，若透析除去變性劑，在氧存在下二硫鍵重新生成，酶活性全部恢復(fù)，并恢復(fù)結(jié)晶能力，說明RNA酶由變性態(tài)恢復(fù)到天然態(tài)。

由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征?？扇苄缘鞍踪|(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化層，同時這些顆粒帶有電荷，因而蛋白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體。4、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)透析法:利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（dialysis）。

5、蛋白質(zhì)的沉淀

如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。

沉淀方法:

⑴鹽析法:在蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的硫酸銨、氯化鈉等中性鹽，可有效地破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層。同時又中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，從而使蛋白質(zhì)顆粒聚而生成沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析（saltingout）。

分段鹽析沉淀反應(yīng)：不同蛋白質(zhì)分子的水膜厚度和帶電量不同，發(fā)生鹽析所需要的鹽濃度不同。改變鹽濃度可分離蛋白質(zhì)混合物，這被稱為分段鹽析法。⑵.有機(jī)溶劑沉淀反應(yīng)降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。改變有機(jī)溶劑的種類和濃度，可分離蛋白質(zhì)混合物，這被稱為有機(jī)溶劑分級法。⑶.重金屬鹽沉淀反應(yīng)在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子的負(fù)離子基團(tuán)（如-COO-）可以與重金屬鹽（如醋酸鉛、氯化高汞、硫酸銅等）的正離子結(jié)合成難溶的蛋白質(zhì)重金屬鹽，并從溶液中沉淀下來。在臨床上，利用這種特性搶救重金鹽中毒的病人和家畜。⑷.生物堿試劑沉淀反應(yīng)生物堿試劑（如苦味酸、單寧酸、三氯醋酸、鎢酸等）在溶液pH小于蛋白質(zhì)等電點時，其酸根負(fù)離子能與蛋白質(zhì)分子上的正離子基團(tuán)相結(jié)合，變成為溶解度很小的蛋白鹽，并從溶液中沉淀下來。臨床化驗時，常用上述生物堿試劑除去血漿中干擾測定的蛋白質(zhì)。（一）、利用溶解度差別的純化方法⑴.等電點沉淀和pH控制蛋白質(zhì)是帶有正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，蛋白質(zhì)分子的電荷性質(zhì)和數(shù)量則因pH不同而變化。蛋白質(zhì)處于等電點時，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。因此在其他條件相同時，它的溶解度達(dá)到最低點。在等電點以上或以下的pH時，蛋白質(zhì)分子攜帶同種符號的凈電荷而相互排斥，阻止了單個分子聚集成沉淀，因此溶解度較大。二、蛋白質(zhì)分離純化方法⑵.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析鹽溶saltingin：在蛋白質(zhì)水溶液中加少量中性鹽，增加分子表面電荷，增強(qiáng)分子與水的作用，使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大的現(xiàn)象。鹽析saltingout：在高濃度的鹽中，離子將蛋白質(zhì)水化膜的水奪去，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀的現(xiàn)象。如飽和硫酸銨。中性鹽影響蛋白質(zhì)溶解度的能力是離子強(qiáng)度的函數(shù)。離子強(qiáng)度（ionicstrength）可以定義為：ci為各離子的濃度，Zi為各離子的凈電荷，Σ表示求和。未解離的電解質(zhì)和攜帶電荷相等的兼性離子不計入電荷的計算，它們不增強(qiáng)溶液的離子強(qiáng)度。⑶.有機(jī)溶劑分級分離法有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因是改變了介質(zhì)的介電常數(shù)（dielectricconstant）。水是高介電常數(shù)物質(zhì)（20℃時，80），有機(jī)溶劑是低介電常數(shù)物質(zhì)（20℃時，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4），因此有機(jī)溶劑的加人使水溶液的介電常數(shù)降低。⑷.溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響在0~40℃之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，但人的血紅蛋白從0~25℃，溶解度隨溫度上升而降低。在40～50℃以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，在中性pH介質(zhì)中失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進(jìn)行。（二）、根據(jù)分子大小不同的純化方法⑴.透析和超過濾dialysisandultrafiltration透析：利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)分開的方法。半透膜：玻璃紙（cellophanepaper，或稱賽璐玢紙）、火棉紙（celloidinpaper，又稱賽璐碇紙）和其他改型的纖維素材料。

超過濾：透析時對半透膜加壓，一般液體與膜表面相切的方向流動，使部分液體透過膜，另一部分液體切向流過膜表面，將膜截留的蛋白質(zhì)分子沖走（反流回樣品槽），避免在濾膜表面堆積塞。樣品含量低時因吸附不能回收而采用此法。蛋白質(zhì)的超濾⑵.密度梯度（區(qū)帶）離心densitygradient(zone)centrifugation蛋白質(zhì)顆粒在有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降快，到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度即停止，最后各種蛋白質(zhì)在離心管（常用塑料管）中被分離成各自獨立的區(qū)帶，在管底小孔分部收集。常用蔗糖梯度，聚蔗糖梯度和其他合成材料。蔗糖便宜，純度高，濃溶液（60％，W/W）密度可達(dá)1.28g/cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，由蔗糖和1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷合成的高聚物，Mr約400,000，需高密度和低滲透壓的梯度時，可用Ficoll代替蔗糖。⑶.凝膠過濾gelfiltration又稱凝膠過濾層析、分子排阻（molecular-exclusion）層析、凝膠滲透（gelpermeation）層析。這是按大小分離蛋白質(zhì)混合物的最有效方法之一。常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖，聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖等。交聯(lián)葡聚糖是由線形的α-1,6-葡聚糖與1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷反應(yīng)而成的化合物，商品名稱為Sephadex。聚丙烯酰胺凝膠（商品名稱為Bio-gelP）是一種人工合成的凝膠，它是由單體丙烯酰胺（acrylamide）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（N,N'-methylenebisacrylamide）共聚而成的。瓊脂糖是從瓊脂中分離制得的，商品名稱微為Sepharose或Bio-GelA，這種凝膠的優(yōu)點是孔徑大，排阻極限高。小分子進(jìn)入凝膠分子內(nèi)，被滯留大分子在凝膠顆粒間移動，較快流出溶劑流動方向按分子量從大到小依次流出

凝膠過濾層析原理（三）、根據(jù)電荷不同的純化方法⑴.電泳electrophoresis電泳或離子泳ionphoresis：在電場作用下，帶電顆粒向與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。

（2）.離子交換層析用于各種兩性分子混合物的分離，蛋白質(zhì)和核酸大分子層析的支持介質(zhì)一般是纖維素離子交換劑和交聯(lián)葡聚糖離子交換劑。陽離子交換劑：CM-纖維素（弱酸型）；P-纖維素（中強(qiáng)酸型）；SE-纖維素（強(qiáng)酸型）；SP-Sephadex（強(qiáng)酸型）；陰離子交換劑：AE-纖維素（弱堿型）；PAB-纖維素（弱堿型）；DEAE-纖維素（中強(qiáng)堿型）；DEAE-Sephadex（中強(qiáng)堿型）；TEAE-纖維素（強(qiáng)堿型）；QAE-Sephadex（強(qiáng)堿型）；（四）、利用對配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法親和層析affinitychromatography：利用蛋白質(zhì)對其配體分子特有的識別能力，即生物學(xué)親和力建立起來的分離純化方法。最先用于酶的純化，現(xiàn)廣泛用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受體、細(xì)胞器甚至完整的細(xì)胞的純化。凝集素親和層析、免疫親和層析、金屬螯合層析（metalchelatechromatography）、染料配體層析和共價層析等都屬于親合層析類抗體和抗原的結(jié)合：高度特異性把抗體作為“魚餌”（配體），分離抗原?！鲇H和層析的操作機(jī)理固相載體(1)(2)(3)SampleWashingElution抗體抗原三、蛋白質(zhì)分子中氨基酸序列的測定①測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和多肽鏈的數(shù)目②拆開蛋白質(zhì)分子的多肽鏈③斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵④分析每一條多肽鏈的氨基酸組成⑤鑒定多肽鏈的N末端和C末端殘基⑥把多肽鏈裂解成兩組以上大小不等的較小片段⑦測定各肽段的氨基酸序列⑧重疊各肽段，重建完整多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)順序⑨確定半胱氨酸殘基間形成的二硫鍵的位置①.多肽鏈數(shù)目的測定根據(jù)蛋白質(zhì)N端和C端殘基的摩爾數(shù)和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量可確定分子中的多肽鏈數(shù)目。若含一條多肽鏈，蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)與末端基的摩爾數(shù)相等；如果后者是前者的倍數(shù)，說明該蛋白質(zhì)分子是由多條多肽鏈組成。如果檢測到的末端基多于一種，表明蛋白質(zhì)由兩條或多條不同的多肽鏈組成，即樣品是雜多聚蛋白質(zhì)（heteromultimericprotein）。②.拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈寡聚蛋白質(zhì)的亞基必須拆分?？捎米冃詣┤?mol/L尿素、6mol/L鹽酸胍或高濃度鹽處理。若亞基間通過二硫橋（S-S）交聯(lián)，如胰島素（含兩條多肽鏈）和α-胰凝乳蛋白酶（含3條多肽鏈）則可用氧化劑或還原劑將二硫鍵斷開。拆開后的單個多肽鏈可根據(jù)它們的大小或/和電荷的不同進(jìn)行分離、純化。

由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).③.拆開多肽鏈內(nèi)的二硫橋多肽鏈內(nèi)半胱氨酸殘基之間的S-S橋必須在進(jìn)行第4步前予以斷裂。

幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化?？梢酝ㄟ^加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。④.測定每一條多肽鏈的氨基酸組成分離純化的多肽鏈一部分樣品完全水解，測定氨基酸組成，計算氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。⑤.鑒定多肽鏈的N端和C端殘基多肽鏈的另一部分樣品進(jìn)行末端殘基的鑒定，以便建立兩個重要的氨基酸序列參考點。*N端測定Ⅰ.二硝基氟苯（DNFB或FDNB，sanger試劑）法

DNFB與AA的α-NH2的反應(yīng)被廣泛用于測定N-末端AA。多肽或蛋白質(zhì)的游離末端NH2與DNFB反應(yīng)生成DNP-多肽或DNP-蛋白質(zhì)對酸水解比肽鍵穩(wěn)定，因此DNP-多肽經(jīng)酸水解后，只有N-末端AA為黃色DNP-AA衍生物，其余的都是游離AA。鑒別DNP-AA，便可得知多肽鏈的N-末端殘基。多肽側(cè)鏈上的ε-NH2、酚OH等也與DNFB反應(yīng)，但生成的側(cè)鏈DNP衍生物，如ε-DNP賴氨酸當(dāng)用有機(jī)溶劑（如乙酸乙酯）抽提時將與游離氨基酸一起留在水相，因而容易和α-DNP氨基酸區(qū)分開來。待分析的DNP-氨基酸可用紙層析、薄層層析或HPLC進(jìn)行分離鑒定和定量測定。Ⅱ.丹磺酰氯（dansylchloride，DNS）法

丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡稱，原理與DNFB法相同。丹磺?；袕?qiáng)烈的熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，且水解后的DNS-AA不需提取，可直接用紙電泳或薄層層析加以鑒定。Ⅲ.苯異硫氰酸酯（PITC，Edman試劑）法

多肽和蛋白質(zhì)的末端氨基和AA的α-NH2