聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分開(kāi)血清蛋白

本文格式為Word版，下載可任意編輯——聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分開(kāi)血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分開(kāi)血清蛋白

[試驗(yàn)?zāi)康腯

(1)學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳原理。(2)把握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)。

(3)比較醋酸纖維薄膜電泳與聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分開(kāi)血清蛋白的操作效果。[試驗(yàn)原理]

帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)作用下，會(huì)向兩極移動(dòng)；帶正電荷的移向負(fù)極，帶負(fù)電荷的移向正極，這種現(xiàn)象稱為電泳。

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Bis)

在加速劑N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨(簡(jiǎn)稱AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)。[試驗(yàn)試劑]

1、待測(cè)樣品：新鮮血清

2、制備分開(kāi)膠、濃縮膠有關(guān)試劑：

(1)凝膠緩沖液：稱取1mol/LHCl48ml,Tris(三羥基氨基甲烷)36.6g,TEMED0.23mL,加重蒸餾水至80mL使其溶解，調(diào)pH8.9，然后加重蒸餾水定容至100mL，至棕色瓶，冰箱保存。(2)分開(kāi)膠貯液，一般有兩種配法：

ⅰ28％Acr-0.735％Bis貯液：丙烯酰胺28.0克，甲叉雙丙烯酰胺0.735克,加重蒸餾水使其溶解然后定容至100mL.

ⅱ30％Acr-0.8％Bis貯液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸餾水使其溶解定容至100mL.以上兩種溶液需用棕色試劑瓶盛放,4℃儲(chǔ)存,一般可放置一個(gè)月左右.

(3)分析純過(guò)硫酸銨(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4℃儲(chǔ)存僅能用一周,最好當(dāng)天配置.上述三種試劑用于制備分開(kāi)膠.

(4)濃縮膠緩沖液:稱取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED0.46mL,加重蒸水至80mL,調(diào)pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4℃儲(chǔ)存.

(5)濃縮膠貯液:稱取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，過(guò)濾后至棕色瓶4℃貯存。

(6)40％蔗糖溶液（W/V）

(7)核黃素4.0mg,加重蒸水溶解,定容至100mL,棕色瓶4℃貯存.以上(4)-(7)4種溶液用于配置濃縮膠.

3.Tris-甘氨酸電極緩沖液(pH8.3)

稱取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900mL,調(diào)pH之后定容至1000mL,4℃貯存,使用前稀釋10倍.

4.0.1％溴酚藍(lán)指示劑.5.染色液

染色液種類較多,染色方法也不完全一致,詳細(xì)染色法如下:方法氨基黑-10B固定甲醇7％乙酸染液0.1mol/LNaOH1％氨基黑7％乙酸中0.5％-1％氨基黑考馬斯亮藍(lán)R25020％磺基水楊酸0.25％R250水液10％三氯乙酸10﹪三氯乙酸-10％中染色時(shí)間5min(室溫)2h(室溫)/10min(96℃)5min(室溫)30min室溫)7％乙酸10﹪三氯乙酸90％甲酸脫色5％乙醇7％乙酸R2501h(室溫)19:1(體積比)5％磺基水楊酸和1％R25019:1(體積比)考馬斯亮藍(lán)G2506％乙酸6﹪乙酸中1％10min室溫)30min室溫)甲醇-水-濃氨64:63:112.5﹪三氯乙酸G25012.5﹪三氯乙酸中0.1﹪G250Ponceau3R12.5％三氯乙酸0.1mol/LNaOH0.1％3R中2min室溫2h(5℃)5％乙醇固綠7％乙酸7％乙酸中1％固7％乙酸綠氨基萘酚磺酸2mol/LHCL浸幾秒鐘0.1mol/L磷酸鹽緩沖液pH6.8中0.003％染料本試驗(yàn)采用0.05％考馬斯亮藍(lán)R250染色液中,含20％磺基水楊酸,其優(yōu)點(diǎn)是染色固定同時(shí)進(jìn)行,背景易脫色.

0.05％考馬斯亮藍(lán)R250的20％磺基水楊酸染液:考馬斯亮藍(lán)0.05g,磺基水楊酸20g,加蒸餾水至100mL,過(guò)濾后至試劑瓶?jī)?nèi)保存.6.脫色液

0.1mol/lNaCl溶液7.保存液

甘油10mL,冰乙酸7mL,加蒸餾水至100mL8.1％瓊脂糖溶液

瓊脂1g,加已稀釋10倍的電極緩沖液,加熱溶解,4℃貯存?zhèn)溆?，使用時(shí)取出加熱成液體，待稍微冷卻后用膠頭滴管吸取使用，膠頭滴管使用完后馬上清洗清白.[試驗(yàn)儀器]

夾心式垂直板電泳槽，樣品槽模板，直流穩(wěn)壓電源（電壓300—600V，電流50—100mA），吸量管（1mL，5mL，10mL），燒杯，修長(zhǎng)頭滴管，1mL注射器及6號(hào)長(zhǎng)針頭，微量注射器，水泵或油泵，真空枯燥器，培養(yǎng)皿（直徑120mm），玻璃板，日光燈一臺(tái)

[試驗(yàn)步驟]一、

安裝夾心式垂直板電泳槽

3min夾心式垂直板電泳槽操作簡(jiǎn)單，不易滲漏，其裝置如圖

1.導(dǎo)線接頭2.下貯槽3.凹形橡膠框1.樣品槽模板2.長(zhǎng)玻璃板4.樣品槽模板5.固定螺絲6.上貯槽3.短玻璃板4.凹形橡膠框7.冷凝系統(tǒng)各部件依以下順序組裝:(1)(2)

裝上貯槽和固定螺絲，勿使上下貯槽在外連通，使用橡皮管時(shí)用夾子夾住.玻璃板洗凈后用吹風(fēng)機(jī)吹干，清洗玻璃板時(shí)不得用刷子刷，可用紗布或海綿擦洗，以免在玻璃表面上留下刮痕，清洗后不得用紙或布擦干，將長(zhǎng)短玻璃板分別插在硅相框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。

(3)(4)(5)

將已插好玻璃板的橡膠框平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽。

將下貯槽的銷孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對(duì)角線方式旋緊螺絲帽。豎直電泳槽，在長(zhǎng)玻璃板下端與硅?？蚪唤绲目p隙內(nèi)參與已溶化的1％瓊脂，其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂應(yīng)避免里面有氣泡。

二、配膠

目前用于PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）凝膠貯液有30％Acr-0.8％Bis及28％Acr-0.735％Bis2種，以它們?yōu)槟敢嚎梢耘渲貌煌瑵舛鹊姆珠_(kāi)膠。不同濃度的分開(kāi)膠及濃縮膠配置方法見(jiàn)下表：試劑名稱用量/mL20mLPAA終濃度5.5％2.507.0％2.5010.0％2.5020mLPAA終濃度5.0％2.507.5％2.5010.0％2.50(1)分開(kāi)膠緩沖液pH8.9Tris-HCl(TEMED)(2)凝膠貯液A.28％Acr-0.735％Bis分B.30％Acr-0.8％Bis離重蒸餾水膠3.935.007.14————————3.57——2.50——0.363.334.175.002.507.140.83充分混勻后，置于真空枯燥器中，抽氣10分鐘（3）0.14％AP(4)濃縮膠緩沖液pH6.7Tris-HCl(TEMED)10102.5％PAA121010103.75％PAA1310濃（5）濃縮膠貯液縮10％Acr-2.5％Bis膠（6）40％蔗糖4充分混勻后，置于真空枯燥器中，抽氣10分鐘3（7）0.004％核黃素

三、制備凝膠板

11PAGE有連續(xù)體系和不連續(xù)體系，其灌膠方式不完全一致，分別表達(dá)如下：

a)連續(xù)體系

本試驗(yàn)采用28％Acr-0.735％Bis凝膠貯液，從冰箱取出各種貯液，平衡至室溫后，按上表的配比配制20mL7.0％凝膠。前三種溶液混合在一小燒杯內(nèi)，（3）號(hào)液?jiǎn)为?dú)放置一小燒杯。二者抽氣后混合均勻，馬上用修長(zhǎng)頭滴管將分開(kāi)膠溶液加到凝膠膜長(zhǎng)、短玻璃板間的夾縫內(nèi)，當(dāng)加至距離短玻璃板上緣約0.5cm時(shí)，中止加膠，輕輕將樣品槽模板（梳子）插入。在上、下貯槽中倒入蒸餾水，液面不能超過(guò)上貯槽的短玻璃板，防止蒸餾水進(jìn)入凝膠之中。作用是增加壓力，防止凝膠滲漏。凝膠液在混合后15min開(kāi)始聚合，約30min-1h完成聚合作用。聚合后，在樣品槽模板梳齒下緣與凝膠界面間有折射率不同的透明帶?？吹酵该鲙Ш罄^續(xù)放置半小時(shí)，再用雙手取出樣品槽模板，動(dòng)作要輕，用力均勻，以防弄破加樣凹槽。凹槽中殘留液體可用窄濾紙條輕輕吸取，切勿插進(jìn)凝膠中，應(yīng)保持加樣槽凹面平整。放掉上、下貯槽中的蒸餾水，在上下兩個(gè)電極槽倒入電極緩沖液，液面應(yīng)沒(méi)過(guò)短玻璃板上方約0.5cm。

b)不連續(xù)體系

不連續(xù)體系采用不同孔徑及pH的分開(kāi)膠與濃縮膠，凝膠制備分