酶工程期末復(fù)習(xí)

本文格式為Word版，下載可任意編輯——酶工程期末復(fù)習(xí)通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。

酶分子修飾的意義：1）提高酶的活力（activity）（2）加強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（stability）（3）降低或消除酶的抗原性（immunologicalproperty）（4）改變酶的動力學(xué)特性，如反應(yīng)溫度、pH、Km

化學(xué)修飾：1、金屬離子置換修飾2、大分子結(jié)合修飾3、小分子修飾（側(cè)鏈基團(tuán)修飾）

4、肽鏈有限水解修飾5、氨基酸置換修飾金屬離子置換修飾（主要針對金屬酶而言）

α-淀粉酶中的Ca2+，谷氨酸脫氫酶中的Zn2+，過氧化氫酶分子中的Fe2+，酰基氨基酸酶分子中的Zn2+,超氧化物歧化酶分子中的Cu2+,Zn2+

金屬離子置換修飾的過程：a.酶的分開純化b.除去原有的金屬離子c.參與置換離子大分子結(jié)合修飾（macromoleculescombinemodification）采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。抗原性降低或消失

聚乙二醇（PEG）、肝素、右旋糖酐、環(huán)糊精、羧甲基纖維素、白蛋白、聚丙烯酸等大分子修飾(共價)的過程

修飾劑的選擇→修飾劑的活化→修飾→分開

PEG和人血清白蛋白在消除酶分子抗原性方面效果較好。精氨酸酶：抗癌作用，經(jīng)PEG結(jié)合修飾，其抗原性消除。L-天冬酰胺酶：經(jīng)PEG結(jié)合修飾后，使抗原性顯著降低甚至消除。絕大多數(shù)酶經(jīng)化學(xué)修飾后，最大反應(yīng)速度Vm并沒有變化，而Km會增大。固定化酶，是指在一定空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。酶的固定化：采用各種方法，將酶固定在水不溶性的載體上，制備成固定化酶的過程。

為什么要制備固定化酶？

固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：可反復(fù)使用，穩(wěn)定性高；易與底物和產(chǎn)物分開，便于分開純化；可實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，提高效率。固定化方法：

物理吸附法特點(diǎn)：操作簡單、條件溫柔、使用過程中酶易脫落，常與其它方法結(jié)合使用。用于廉價酶固定化。載體：

有機(jī)載體纖維素、膠原、淀粉等無機(jī)載體活性炭、氧化鋁、皂土等

離子吸附法特點(diǎn)：主要用于固定化酶，制備比較簡單，操作時要注意控制好底物液的pH值，酶就不至于流失過快。載體：離子交換劑

離子吸附法固定化酶和離子換層析純化酶的區(qū)別？

凝膠包埋法特點(diǎn)：廣泛應(yīng)用于酶的固定化。不適合猛烈攪拌及底物分子過大狀況。載體：自然凝膠海藻酸鈉凝膠、角叉菜凝膠、明膠、瓊脂、卡拉膠等合成凝膠聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇、光交聯(lián)樹脂等微膠囊包埋法特點(diǎn)：適合于小分子底物和產(chǎn)物的酶的固定化。載體：聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等

共價鍵結(jié)合法特點(diǎn)：酶穩(wěn)定性好，可連續(xù)使用較長時間。酶活損失較大?？少徺I商品化酶固定化載體。

載體：自然高分子衍生物、合成高聚物、無機(jī)載體交聯(lián)法特點(diǎn)：往往與別的方法結(jié)合使用。載體：雙功能試劑

交聯(lián)法固定酶：使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。

分子內(nèi)交聯(lián)修飾：

項目物理吸附離子吸附凝膠包埋微囊包埋共價交聯(lián)原理表面能作用載體鍵合

制備難易簡單簡單較簡單較難固定化強(qiáng)弱弱中等較強(qiáng)較強(qiáng)強(qiáng)酶活力損失費(fèi)用低操作穩(wěn)定性較易流失

穩(wěn)定

極少很少少

少

多

較易

異電荷吸附

網(wǎng)絡(luò)包被作用膜包被作用

共價結(jié)合交聯(lián)劑-酶鍵合酶-

難

強(qiáng)多

較低中等較高較低高易流失較易流失

抗剪切力弱

抗剪切力弱

適用性酶廉價

用于酶和細(xì)胞應(yīng)用較廣泛和細(xì)胞工業(yè)用酶；細(xì)胞不宜固定化酶的穩(wěn)定性：

最適反應(yīng)pH：

評價固定化酶的指標(biāo)：大部分酶經(jīng)固定化后活力會下降！

1、固定化酶的活力

固定化酶用1g（或每平方厘米）干固定化酶（細(xì)胞）每分鐘轉(zhuǎn)化1微摩爾底物為產(chǎn)物的酶量，為1個活力單位（umol/min.g或umol/min.cm2），有人稱之為固定化酶的比活力。

2、固定化酶效率、活力回收率和相對酶活力（1）固定化效率

一定量的酶經(jīng)固定化以后，被載體固定化的酶量占固定化之前該酶量的百分比，稱為固定化效率，也稱結(jié)合率、偶聯(lián)率。

固定化效率（%）=參與的酶總活力單位—未被固定化的酶活力單位

參與的酶總活力

不宜于大分子底物；廣泛

主要應(yīng)用于醫(yī)藥酶

酶

2）活力回收率

固定化酶活力與未固定化前的活力之比，稱為活力回收率。

活力回收率（%）=

（3）相對酶活力

固定化酶活力與實(shí)際消耗于固定化酶活力的百分比稱為相對酶活力。相對酶活力（%）=

將總活力為20萬單位的α－淀粉酶吸附固定化，測得固定化酶活力為16萬單位，固定化處理過程中收集的剩余溶液酶活力為2萬單位，計算酶的固定化效率、活力回收率和相對活力。

固定化細(xì)胞的制備方法吸附法包埋法

1.尋常酶的固定化方法有法，法，法和法。2.固定化酶和游離酶相比，有何優(yōu)缺點(diǎn)？

3.將3g葡萄糖氧化酶用離子交換吸附法固定到DEAE-纖維素上，制成固定化酶，測得固定化酶的酶活力為25000IU，而溶液中剩余葡萄糖氧化酶的酶活力為3000IU，同時測得含3g葡萄糖氧化酶總活力為31000IU，求固定化葡萄糖氧化酶的相對活力。4.糖化酶總活力為８０００單位，固定化處理后收集的洗滌液中，測出的活力為１２００單位，計算該酶樣品的固定化效率。

5.熱處理固定法僅適用于一些耐熱性較好的酶（判斷正誤）1.酶在競爭性抑制劑存在下，反應(yīng)動力學(xué)方程KmVm、。2.微生物酶發(fā)酵生產(chǎn)的生產(chǎn)種子制備要經(jīng)過、和三階段培養(yǎng)。

3粗過濾技術(shù)按推動力分為、減壓過濾和。4.SDS—PAGE中SDS的功能是、。5.酶結(jié)晶和沉淀都可采用的方法和。6.凝膠包埋法制備固定化酶常用自然凝膠：、

7.不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳分開酶（蛋白質(zhì)）三種效應(yīng)是指濃縮效應(yīng)、和。

8.酶的凝膠包埋常用的人工合成凝膠有：————和————。9.酶的固定化方法有：———、———、———、———。10.目前工業(yè)用酶的生產(chǎn)方法主要是。

11.結(jié)晶過程可以分為三步：、、。

12.根據(jù)酶和蛋白質(zhì)在穩(wěn)定性上的差異而建立的純化方法有法、酸堿變性法和表

面變性法。酶的非水相催化：有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系種類：微水介質(zhì)體系運(yùn)用最廣泛與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系與水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相或多相體系

必需水：維持酶酶分子完整的空間構(gòu)象所需的最低水量。不同酶必需水不同；同一酶在不同有機(jī)溶劑中必需水量不同，溶劑疏水性越強(qiáng)，需水量越少。膠束體系和反膠束體系

最適水含量：催化反應(yīng)速度達(dá)到最大時的水含量稱為最適水含量。適合的有機(jī)溶劑介質(zhì)：2≤lgP≤5

在有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)中，酶所處的pH環(huán)境與酶在凍干或吸附到載體上之前所使用的緩沖液pH一致。這種現(xiàn)象稱為pH印記或pH記憶。定向進(jìn)化：

隨機(jī)突變方法：易錯PCR技術(shù)、DNA(DNAShuffling)重排技術(shù)

易錯PCR技術(shù)：從酶的單一基因出發(fā)，在改變反應(yīng)條件的狀況下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），使擴(kuò)增得到的基因出現(xiàn)堿基配對錯誤，從而引起基因突變的技術(shù)過程。DNA(DNAShuffling)重排技術(shù)：又稱為DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫中分開得到的同源DNA，用酶切割成隨機(jī)片度，經(jīng)過不加引物屢屢PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。基因家族重排技術(shù)：

填充床式反應(yīng)器（PCR，PBR)又稱活塞流反應(yīng)器特點(diǎn)：將固