多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定方案總結(jié)

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經(jīng)過分級純化的多糖在測定結(jié)構(gòu)前須檢查其純度及測定分子量。檢查純度最常用的判斷方法：

（1）用GC、HPLC測定組成多糖的單糖的摩爾比是否恒定。用不同的柱型測定結(jié)果更為可靠。（2）電泳只出現(xiàn)一條帶。

如可用聚丙烯酰胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳及玻璃纖維紙電泳。對于中性多糖可采用高壓電泳，以硼酸鹽為緩沖液，可增大其遷移速度。

（3）凝膠柱層析圖浮現(xiàn)對稱的單峰。若有“拖尾〞現(xiàn)象，說明其均一性不夠好。陰離子交換層析純化

用DEAE一纖維素52(2.6x100cm)柱層析,0.lmol/LNaCl洗脫,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管檢測,繪制收集體積與糖含量之間的關(guān)系曲線?？词欠裼袉我粚ΨQ峰。

依照Ye等報(bào)道,采用DEAE一52一纖維素交換柱層析法(2.6x30cm)對鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進(jìn)行初步分開。DEAE一纖維素凝膠預(yù)處理:稱取DEAE一52一纖維素凝膠干粉,參與約10倍體積質(zhì)量比(ml/g)的0.5mol/LNa0H溶液浸泡30分鐘,倒出上清液,用大量去離子水反復(fù)浸洗至pH值近中性;再用一致體積的0.5mol/LHCI溶液浸泡30分鐘,倒出上清液,用大量去離子水反復(fù)浸洗至pH值近中性;最終用一致體積的0.5mol/lNaOH溶液再浸泡30分鐘,用大量去離子水反復(fù)浸洗至pH值中性。處理完畢后,進(jìn)行濕法裝柱,用去離子水0.5mol/LNaCl溶液,去離子水依次分別平衡(流速1.0ml/min)2一3個(gè)柱體積備用.

糖樣100mg溶于5ml的去離子水中,離心除去不溶物,上樣于DEAE一52一纖維素陰離子

-1

層析柱(2.6x30cm,Cl型),分別采用去離子水0.1和0.3mol/LNaCI溶液進(jìn)行分段梯度洗脫,流速1.0ml/min,自動收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)。吸光值(490nm)為縱坐標(biāo)繪制DEAE一52一纖維素色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型,合并一致組分,50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,對去離子水透析48h以去除NaCI及小分子雜質(zhì),最終將透析內(nèi)液冷凍枯燥,得初步純化產(chǎn)品。

初步純化多糖得率計(jì)算公式:

多糖得率(%)=純化多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量x100%葡聚糖凝膠層析純化

采用SephadexG-100凝膠層析法對DEAE-52一纖維素初步純化的不同組分的多糖樣品進(jìn)一步純化。葡聚糖凝膠(sephadexG一100)的預(yù)處理:稱取sephadexG一100凝膠干粉,參與30倍體積質(zhì)量比(ml/g)的去離子水,沸水浴5小時(shí)使其溶脹。冷卻后用去離子水反復(fù)浸洗,減壓脫氣后進(jìn)行濕法裝柱,用0.1MNa2SO4;溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3個(gè)柱體積備用。

分別稱取經(jīng)DEAE一纖維素一52初步純化的各多糖組分樣品20mg,溶于2ml0.1MNa2SO4溶液中,上樣于SephadexG一100層析柱(2.6x60cm)用0.1MNa2SO4溶液溶液洗脫,流速0.25ml/min,分步收集(5ml/管)。

用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)。吸光值(490nm)為縱坐標(biāo)繪制sePhadexG一100色譜柱洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型,合并一致組分,50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,對去離子水透析48h以去除Na2SO4;及小分子雜質(zhì),最終將透析內(nèi)液冷凍枯燥,得不同純化產(chǎn)品。

純化多糖得率計(jì)算公式:

純化多糖得率(%)=純化多糖質(zhì)量/粗多糖質(zhì)量x100%（鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖）（4）紙層析法呈單一集中斑點(diǎn)。

取0.5%的多糖樣品溶液50ul,點(diǎn)樣于新華中速濾紙(3cmx20cm)距端點(diǎn)1cm處的中部,以正丁醇:濃氨水:水(4O:50:5)為展開劑,飽和2小時(shí)以上,在室溫下展開6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺藍(lán)液染色,馬上用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一個(gè)明了的斑點(diǎn)。

（5）瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳法

在瓊脂糖板(厚度為0.2cm)上點(diǎn)樣3一5ul采用濃度為0.075mol/L,pH8.6的巴比妥緩沖液,電泳1-1.5h,電壓為64一80V,甲苯胺藍(lán)(濃度為1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脫色。多糖純品經(jīng)電泳展開后,看是否浮現(xiàn)單一斑點(diǎn),斑點(diǎn)是否明了。

（6）紫外分光光度法

將多糖PWZ加0.9%NaCI溶液溶解,配成濃度為1mg/ml的溶液,采用UV一16OA紫外可見光譜儀掃描(200nm一30Onm)觀測260nm、280nm處是否有吸收峰。

多糖的分子量測定：

過去用超速離心沉降法、光散射法、滲透壓法、粘度法等，這些方法操作繁雜且誤差較大，現(xiàn)已少用?，F(xiàn)在較常用的方法有凝膠過濾法和高效凝膠液相色譜法，這兩種方法須先用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)多糖對照測定樣品的分子量。

一般來說，多糖結(jié)構(gòu)分析包括以下幾點(diǎn)：

（1）單糖組成分析：研究確定單糖的種類及摩爾比；

完全酸水解后用高效液相色譜方法(HPLC)或氣相色譜方法測定。（2）糖苷鍵類型：研究確定糖苷鍵及支鏈點(diǎn)連接位置；

甲基化分析方法

高碘酸氧化法與Smith降解法

（3）糖環(huán)大?。貉芯看_定糖苷鍵為呋喃糖或吡喃糖；紅外光譜

（4）異頭碳構(gòu)型：研究確定糖苷殘基的a-或P-構(gòu)型；

2DNMR.(TwodimensionalNuclearMagneticResonance)光譜分析方法測（5）確定單糖殘基和重復(fù)單元的序列

甲基化分析方法與磁共振光譜分析方法結(jié)合分析，一般會參考多糖的單糖組成及摩爾比信息以利于解析多糖結(jié)構(gòu)。

高碘酸氧化法

薄層層析(TLc)——定性，氣相色譜法

（6）取代基團(tuán)位點(diǎn)：研究0H-修飾基團(tuán)的種類和取代位點(diǎn)，如0-磷酸化，乙醜基取代，0-

硫酷化等；

比色分析方法

（7）多糖分子量分布的研究。

紫外光譜

定性與定量方法薄層層析：殘基定性氣相色譜：殘基定量氣質(zhì)聯(lián)用：殘基定量

高效陰離子色譜法：殘基定量鑒定結(jié)構(gòu)常用物理化學(xué)方法：

高效液相色譜:確定單糖組分和相對分子量

紅外光譜分析:測定多糖的官能團(tuán)，不僅可以檢測酮糖、酵糖的恥喃糖環(huán)或呋喃糖環(huán)的構(gòu)象和糖苷鍵的構(gòu)型

核磁共振:α-構(gòu)型與β-構(gòu)型殘基的比例；判斷異頭碳構(gòu)型；推斷主鏈和支鏈連接鍵型鑒定結(jié)構(gòu)復(fù)合方法：

甲基化分析:推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例

高碘酸氧化法與Smith降解法:判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數(shù)目

糖睛乙酸酷衍生物的氣相色譜法:單糖組成和摩爾比

各種多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定方法的具體實(shí)施方案1、酸水解

（1）完全酸水解

-1

稱取20mg樣品,參與2mL2mol·L的H2SO4于安培管中沸水浴水解8h,水解液用BaCO3中和至pH=7,離心,取上清夜置冰箱冷藏備測。（阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分開純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）（2）部分酸水解稱取糖樣70mg，80℃條件下，0.05M三氟乙酸水解2h。降至室溫后，離心（4000r/min，10min），將沉淀枯燥，留做GC分析。上清用無水乙醇除酸至中性(pH為6～7)，蒸餾水透析48h：將袋外透析液濃縮，真空枯燥，留做GC分析；袋內(nèi)液濃縮至5ml左右，加10倍體積無水乙醇，醇沉過夜，離心(4000r/min，10min)，沉淀常規(guī)枯燥，作GC分析；上清濃縮，真空枯燥，留做GC分析。2、高效液相色譜

確定樣品的單糖組成色譜條件為:

色譜柱為ShodexKS804Sugar(300mm×7.8mm)柱溫40度滾動相為水

-1

流速0.8mL·min

檢測用410RⅠ示差檢測器，數(shù)據(jù)處理用810GPC軟件進(jìn)行。

同時(shí)用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、巖藻糖8種單糖進(jìn)

行對照,根據(jù)峰值確定樣品的單糖組成。

分子量的測定以標(biāo)準(zhǔn)分子量的葡聚糖Pulluan作分子量測定標(biāo)準(zhǔn)。讓其通過高壓液相色譜柱,條件同上,先以分子量對數(shù)與對應(yīng)的保存時(shí)間作標(biāo)準(zhǔn)曲線,從標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Pulluan的工作曲線上可以求得該成分分子量。例如：（阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分開純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）

將水解后的多糖樣品PW2進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果如表所示:阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖PW2經(jīng)過酸水解后,得到2種單糖:葡萄糖和半乳糖,摩爾比例1.77∶1。例如：

4

經(jīng)HPLC測定后對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得多糖PW2的分子量為3.18×10。（阿魏側(cè)耳子實(shí)體多糖分開純化及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究）

4、甲基化分析(1)基本原理

先將多糖中各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，然后將多糖中的糖苷鍵進(jìn)行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羥基所在的位置，即為原來單糖殘基的連接點(diǎn)。同時(shí)根據(jù)不同甲基化單糖的比例，可以推測出此種連接鍵型在多糖重復(fù)結(jié)構(gòu)中所占的比例。

用此種方法得到的羥基及NaBH4還原醛基后產(chǎn)生的羥基，經(jīng)乙?；傻玫郊谆奶谴家宜狨?此產(chǎn)物易揮發(fā)，可進(jìn)行GC分析)，再經(jīng)GC與GC-MS分析，通過氣相色譜的出峰順序和對質(zhì)譜譜圖的主要離子碎片的分析便可以較確鑿地確定糖的連接鍵型。反應(yīng)通式如下:

（2)甲基化反應(yīng)

取充分枯燥的多糖樣品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亞礬（DMSO)中。在N2保護(hù)下快速參與枯燥的NaOH粉50mg，用N2排出空氣，加蓋密封，室溫反應(yīng)1.0h并間歇振蕩。在N2保護(hù)下緩慢滴加碘甲烷1.0ml，用N2排出空氣，加蓋密封，室溫繼續(xù)反應(yīng)1.0h并間歇振蕩，反應(yīng)完成后加0.5ml水終止反應(yīng)。反應(yīng)液先用自來水流水透析48h，再用蒸餾水透析24h，透析液冷凍枯燥得第一次甲基化樣品。第一次甲基化樣品繼續(xù)甲基化，反應(yīng)步驟同上，得其次次甲基化樣品。如此重復(fù)甲基化三次。甲基化后的樣品用紅外光譜檢測，3700

cm-1—3100cm-1，附近無羥基的特征吸收峰，說明甲基化反應(yīng)完全。（3)甲基化樣品的衍生化

上述完全甲基化多糖樣品參與2mol/1的三氟乙酸(TFA)3.0ml,120℃密閉水解2.0h。冷卻后50℃減壓蒸發(fā)干，加2.0ml甲醇再蒸發(fā)干，重復(fù)三次，最終蒸發(fā)干得完全甲基化多糖的水解產(chǎn)物。加蒸餾水2.0ml使其溶解，再加硼氫化鈉25mg，振蕩后室溫還原反應(yīng)2.0h。反應(yīng)完后滴加0.1mol/1醋酸分解過量的硼氫化鈉并調(diào)pH值至5.5~7.0弱酸性。反應(yīng)液50℃減壓蒸發(fā)蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重復(fù)三次，最終蒸發(fā)干。

上述蒸發(fā)干樣品參與1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管后在沸水浴中反應(yīng)1.0h。反應(yīng)液50℃減壓蒸發(fā)干，加2.0ml甲醇再蒸發(fā)干，重復(fù)三次，最終蒸發(fā)干。參與丙酮1.0ml，用0.45ul尼龍微孔濾膜過濾，取樣進(jìn)行GC/MS分析。(4)衍生化樣品的GC/MS分析

多糖樣品經(jīng)甲基化、水解、還原、乙?；蟮玫郊谆谴家宜狨ィM(jìn)行GC/MS聯(lián)機(jī)分析，根據(jù)文獻(xiàn)的相對保存時(shí)間和不同單糖的主要離子碎片(m/e），推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例。

本試驗(yàn)采用的條件為:GC(VarianCP3800型)和MS（VarianSatum2200型)氣相一質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25um);程序升溫，初溫80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min;氦氣作載氣，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比1:50，柱流速1.0ml/min;電子電離源(EI源)70eV，倍增器電壓350V，燈絲電流250uA，接口溫度260℃,離子源溫度180℃，質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍30~450，掃描速率2.5scan/sec。（胞式層孔菌菌絲體多糖分開純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性研究）

流程圖如下：（MAEP-2a-2b是安絡(luò)小皮傘菌絲體多糖的某個(gè)過程中第某個(gè)樣品）

量各管223nm處的吸光值。以混合液中的NaI04濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制NaIO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)高碘酸氧化

確切稱取多糖樣品25mg，用15mmol/1的NaIO4溶液將多糖配成1.0mg/ml〕溶液，振蕩使其溶解。2h后取多糖溶液0.1ml稀釋250倍至25ml，分光光度計(jì)測量223nm處的吸光值。多糖溶液置4℃冰箱，暗處反應(yīng)，并間歇振蕩。間隔6h取樣0.1ml稀至25ml，測223mn處吸光值，直至吸光值基本穩(wěn)定。根據(jù)反應(yīng)前后的吸光值和NaIO4標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NaIO4消耗量。加乙二醇1.0ml，靜置反應(yīng)1h以還原過量的高碘酸。

取反應(yīng)液1.0ml，加50ul酚酞指示劑，用0.5mmol/L的NaOH溶液滴定，計(jì)算甲酸的生成量。反應(yīng)液加硼氫化鈉50mg，靜置反應(yīng)20h以還原多糖醛成穩(wěn)定的多羥基化合物。用0.1mol/L的乙酸調(diào)反應(yīng)體系的pH值為5.5-7.0，分解多余的硼氫化鈉。反應(yīng)液用自來水流水透析48h，再用蒸餾水透析24h。透析液50℃減壓蒸發(fā)至干，參與甲醇2.0ml，再蒸干，如此重復(fù)3次，最終蒸干獲多糖的高碘酸氧化產(chǎn)品待作Smith降解使用。（4)Smith降解及GC分析

將減壓蒸干的多糖高碘酸氧化產(chǎn)品，進(jìn)行三氟乙酸(TFA)水解，再制備糖腈乙酸酯衍生物，最終用GC進(jìn)行檢測。

7、糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法（鮑氏層孔菌菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)分析）（1）多糖樣品水解采用完全酸水解法。

稱取多糖樣品5mg置安瓶瓶中,參與2mol/1三氟乙酸(TFA)2ml封管,120℃水解2小時(shí)。水解液50℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,參與甲醇約2ml,再蒸發(fā)干,如此重復(fù)3次,最終蒸干待作衍生化使用。

(2)糖腈乙酸酯衍生物的制備

水解后的糖樣中參與10mg鹽酸羥胺、5mg肌醇(內(nèi)標(biāo)物)、0.6ml吡啶，封口，放入90℃水浴中加熱反應(yīng)30min并振蕩。冷至室溫，再參與1.0ml醋酸酐，90℃水浴中繼續(xù)反應(yīng)30min，冷卻后得糖腈乙酸酯衍生物。反應(yīng)產(chǎn)物可直接用于氣相色譜分析。(3)衍生物的氣相色譜檢測

本試驗(yàn)采用的條件為:Agilent6890N氣相色譜儀，5%苯甲基硅氧烷毛細(xì)管色譜柱HP-5，30.0mX320umX0.25um;氫火焰離子檢測器(FID);色譜柱程序升溫:1200C保持3min，以30C/min速度升溫至2100C,2100C再保持4min;進(jìn)樣口、檢測器溫度分250℃、280℃;進(jìn)樣體積1.0ul,氮?dú)?、氫氣和空氣的流速分別是25ml/min,30ml/min,400ml/min。(4)標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生與檢測

鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖等標(biāo)準(zhǔn)單糖同樣進(jìn)行糖睛乙酸酷衍生化，然后以同樣條件進(jìn)行氣相色譜分析。

根據(jù)色譜圖中各色譜峰的出峰時(shí)間、峰面積以及單糖本身的摩爾質(zhì)量可知樣品的單糖組成和摩爾比。計(jì)算公式:Wx=(Ax*Wi)/(Ai*f)。

公式中Wx一樣品中單糖質(zhì)量(mg);

Wi一樣品中參與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量(mg);AX—樣品中單糖的峰面積;Ai—樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積;

f—相對校正因子:f=Wi*As/(Ws*Ai)。8、薄層層析(TLc)單糖殘基的定性分析(猴頭菌實(shí)體多糖)薄層層析(TLc)：取2mg多糖樣品放入薄壁長試管中,參與2mol/L三氟乙酸(TFA)4mL,在110℃

下水解,中性多糖樣品水解2h,含糖醛酸樣品水解4h。樣品水解溶液減壓蒸干(低于40℃)后,參與3mL甲醇再蒸干,重復(fù)以上步驟4一5次,以完全除去TFA。再向樣品中參與0.5mL左右的蒸餾水使樣品完全溶解,取5uL在纖維素板上進(jìn)行薄層層析,展開劑采用乙酸乙酯:吡啶:醋酸:水(5:5:1:3),顯色劑為苯胺一鄰苯二甲酸,110℃加熱10min后顯色,以標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品為對照。

(山藥多糖)

9、氣相色譜法（猴頭菌體多糖）

（1）標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品的乙?；?/p>

縝密稱取等摩爾(2mmol/L)的半乳糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖，分別溶于3mL蒸餾水中，參與20-30mg硼氫化鈉(NaBH4)，于室溫下，間歇振蕩，還原3h，然后用冰醋酸中和過量的NaBH4，至溶液不再產(chǎn)生氣泡為止，pH應(yīng)在4-5之間，參與3mL甲醇，減壓濃縮蒸干，重復(fù)4-5次，以除去反應(yīng)副產(chǎn)物硼酸及水分，然后置于真枯燥器中過夜。次日，110℃烘箱中加熱15min，充分除去殘留的水分后，參與4mL醋配，100℃反應(yīng)1h，冷卻，然后參與3mL甲苯，減壓濃縮蒸干，重復(fù)4-5次，以除去多余的醋酐。將乙酰化后的產(chǎn)物用3mL氯仿溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，參與少量蒸餾水充分震蕩后，除去上層水溶液，如此重復(fù)4次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉枯燥，定容至10mL待GC和GC-MS分析。

（2）樣品的乙?；幚?/p>

取2mg多糖樣品，放入薄壁長試管中，參與2mol/L的三氟乙酸(TFA)4mL，在110℃水解2h。將水解液低于40℃減壓蒸干，然后參與3mL甲醇蒸干，重復(fù)上述操作4-5次，以完全除去TFA。然后依照上述的方法進(jìn)行還原、乙酞化，用氯仿定容至5m1，待GC和GC-MS

分析。

（3）GC分析及定量

分別用單個(gè)單糖的標(biāo)樣按（1）法處理后用GC測定，確定每個(gè)單糖的保存時(shí)間。然后用單糖的混標(biāo)按（1）法處理后用GC測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，確定混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的氣相色譜圖和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD1)。最終按（1）法平行處理六個(gè)混標(biāo)樣品后用GC測定，確定其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD2)。

糖的定量分析:計(jì)算各糖組分的峰面積，利用面積歸一法求出各糖組分的百分比例，并計(jì)算每種單糖的響應(yīng)因子。然后根據(jù)等摩爾的標(biāo)樣組分，計(jì)算出樣品的摩爾比。（4）色譜條件

氣相色譜儀(GC)配備DB-23石英毛細(xì)管柱，30mX0.25mmX0.25um。氫火焰離子化檢測器(FID)，高純氮作載氣。程序升溫:柱初溫120℃，以15℃/min升至240℃，恒6.5min。進(jìn)樣口溫度250℃，分流比1:50。檢測器溫度250℃氫氣35mL/min，空氣350mL/min，尾吹氣30mL/min。柱流速為1mL/min。