微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)報(bào)告材料4803

word微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù)〔未知樣品的消化、蒸餾、滴定與其含氮量的計(jì)算等〕二、實(shí)驗(yàn)原理凱氏定氮法常用于測定天然有機(jī)物〔如蛋白質(zhì)，核酸與氨基酸等〕的含氮量。當(dāng)天然含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫被氧化成二氧化碳和水，而氮如此變成氨并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程稱為“消化〞。此過程進(jìn)展的相對較為緩慢，通常需要參加硫酸鉀或硫酸鈉以提高溶液的沸點(diǎn)，并參加硫酸銅作為催化劑，以促進(jìn)反響的進(jìn)展。氧化劑過氧化氫也能加速反響。消化過程：2NHHSO(NH)SO4324421/12word含氮有機(jī)物HSOCOSOHONH324222蒸餾：在消化完全的樣品溶液中參加濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣。反響方程式如下：(NH)SO2NaOHNaSO2NHOH424244吸收與滴定：蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)展吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止〔即滴定至藍(lán)紫色)，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)〔相當(dāng)于待測物中氨的當(dāng)量數(shù)〕計(jì)算出待測物中的氮量。NHHBONHHBO333342NHHBOHCLNHCLHBO342343三、實(shí)驗(yàn)試劑、材料和器材實(shí)驗(yàn)材料：食用面粉。實(shí)驗(yàn)試劑：濃硫酸、30%氫氧化鈉溶液、克氏催化劑、2%硼酸、2/12word指示劑、0.01MHCL。實(shí)驗(yàn)器材：凱氏燒瓶、電爐、凱氏定氮蒸餾裝置、錐形瓶、100ml容量瓶、酸式滴定管。四、操作步驟〔1〕準(zhǔn)確稱取1克食用面粉，用稱量紙卷好小心送入至50毫升的凱氏燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上；〔2〕向另一燒瓶參加1ml水作空白對照；在每個燒瓶內(nèi)參加硫酸鉀—硫酸銅混合物〔克氏催化劑〕少許，濃硫酸10ml，小瓷片兩粒，搖勻；〔3〕將燒瓶約60度角固定在鐵架上，每個瓶口放一小漏斗，在通風(fēng)廚內(nèi)的電爐上消化；〔4〕在〔5〕待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明綠色為止；消化開始時，應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸；〔6〕消化完畢，待燒瓶內(nèi)容物冷卻后，加蒸餾水10ml〔注意慢加，邊加邊搖〕；〔7〕冷卻后將瓶中內(nèi)容物轉(zhuǎn)入100ml的容量瓶中，并用蒸餾水3/12word洗燒瓶數(shù)次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度搖勻，做上記號備用?！?〕蒸餾器洗凈后，開放水龍頭P3，使水進(jìn)入A室，水放至A室球部2/3處即可。〔2〕取3個50ml的錐形瓶，分別參加10ml硼酸〔內(nèi)加有混合指示劑〕。用外表皿復(fù)蓋備用?！?〕加樣①用移液管吸取2ml消化液，小心地由漏斗D傾入B室；②取一個盛有硼酸的錐形瓶，置于M管下，使管口恰好接觸硼酸溶液，用量筒從漏斗D參加30%氫氧化鈉5ml，隨即將P4夾緊，并往漏斗參加少量蒸餾水封閉。〔4〕蒸餾①用酒精燈加熱，維持火力恒定，沸騰不可高于Y管口以免A室溶液從Y管倒吸，待第一滴蒸餾液從冷凝柱F頂端滴下時起，繼續(xù)蒸餾5分鐘；②然后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開液面再蒸2分鐘，最后用蒸餾水洗導(dǎo)管外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶準(zhǔn)備滴定。4/12〔5〕空白蒸餾①用移液管分別吸取2ml蒸餾水按上述操作步驟進(jìn)展蒸餾。儀器的洗滌：〔1〕蒸餾完畢，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)展滴定錐瓶內(nèi)溶液，溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榈仙蚧疑?，即為終點(diǎn)?！?〕記錄所用鹽酸的量。5/12word（AB）0.010014100樣品的總氮含量（克氮％）C1000假如測定的樣品含氮量局部只是蛋白質(zhì)如此：樣品的總蛋白含量（克蛋白％）（AB）0.0100146.25100C1000式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)；B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)；C為稱量樣品的克數(shù)：0.0100為鹽酸的當(dāng)量濃度〔實(shí)際上，此項(xiàng)應(yīng)按實(shí)驗(yàn)中使用鹽酸的實(shí)際濃度填寫〕；14為氮的原子量；6.25為常數(shù)〔1毫升0.1N鹽酸相當(dāng)于0.14毫克氮〕。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果序號稱量樣品(g〕滴定樣品用去的鹽酸〔ml〕滴定空白用去的鹽酸〔ml〕116/12word21滴定樣品用去鹽酸平均值15.215.4215.（3ml）（AB）0.020014100樣品的總氮含量（克氮％）C10000.43％假如測定的樣品含氮量局部只是蛋白質(zhì)，如此：樣品的總蛋白含量（克蛋白％）（AB）0.0200146.25100、C10002.66％式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)；B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)；C為稱量樣品的克數(shù)：0.0100為鹽酸的當(dāng)量濃度〔實(shí)際上，此項(xiàng)應(yīng)按實(shí)驗(yàn)中使用鹽酸的實(shí)際濃度填寫〕；14為氮的原子量；6.25為常數(shù)〔1毫升0.1N鹽酸相當(dāng)于0.14毫克氮〕。六、須知事項(xiàng)1.本法適用于0.05-3.0mg氮，樣品中含氮量過高時，如此應(yīng)減7/12word少取樣量或?qū)右合♂尅?.勿使樣品粘于燒瓶頸部。放置液體樣品時，需將吸管插至燒瓶底部再放樣：如固體樣品，可將樣品卷在紙內(nèi)，平插入燒瓶底部，然后再將燒瓶直起，紙卷內(nèi)的樣品即完全放在燒瓶底部。3.蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后移開酒精燈，絕不能先滅燈，否如此吸收液將發(fā)生倒吸。4.硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40°C，否如此氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。混合指示劑在堿性溶液中呈蘭綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。七、思考題1.寫出一下各步的化學(xué)反響方程式:蛋白質(zhì)的消化、氨的蒸餾、氨的滴定。答：蛋白質(zhì)的消化:含氮有機(jī)物HSOCOSOHONH2422238/12word氨的蒸餾：NHSO2NaOHNaSO2NHOH424244NHOHHONH342NHHBONHHBO333342氨的滴定：NHHBOHCLNHCLHBO342343答：①在消化過程中，消化時間，催化劑，濃硫酸都要一樣，一定要消化完全。在消化過程中蛋白質(zhì)附著在凱氏燒瓶壁上沒有被消化也會影響最終的濃度。②蒸餾過程中，蒸餾出來的液體量一定要一樣，因?yàn)椴灰粯拥恼麴s水，最后結(jié)果不一樣，在蒸餾的過程中一開始要參加買的蒸餾水，蒸餾過程中參加的是自己用自來水蒸餾的。蒸餾中出氣孔的管子一定要插入硼酸液面以下，蒸餾過程中保證冷凝水一直在流動。蒸餾過程中定氮儀各連接處應(yīng)使玻璃對玻璃外套橡皮管絕對不能漏氣。參加消化液后加氫氧化鈉應(yīng)小心緩慢參加，開關(guān)甲不能常開，加完后加水液封。③滴定過程中應(yīng)一滴一滴參加，滴定速度過快容易滴定過量。滴定過程中仰視刻度結(jié)果偏小，視俯刻度線結(jié)果偏大。9/12word④蒸餾裝置的洗滌過程中洗滌不干凈也會導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)。⑤本實(shí)驗(yàn)方法適合測量0.05-3.0mg氮，含量過大應(yīng)該減少取樣量或者樣液稀釋。否如此會產(chǎn)生誤差。3.消化過程中產(chǎn)生何種有毒氣體？如何判斷消化終點(diǎn)？答：可能會產(chǎn)生一氧化氮、二氧化氮、二氧化硫。消化終點(diǎn)判定：在消化開始時，應(yīng)控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內(nèi)水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO白煙后，適當(dāng)加強(qiáng)火2力，繼續(xù)消化，直至消化液呈透明綠色為止。八、討論經(jīng)過本次利用微量凱氏定氮法進(jìn)展面粉中蛋白質(zhì)的粗測定實(shí)驗(yàn)，使我較為熟練的掌握了凱氏定氮蒸餾裝置的使用，并且了解了其工作原理，這對于以后的學(xué)習(xí)是有很大幫助的。經(jīng)查閱資料得，面粉中蛋白質(zhì)的含量大概在9％左右，本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為2.66％，總體來講，本次試驗(yàn)較為失敗，沒能夠粗略地測量出了面粉中蛋白質(zhì)的含量。經(jīng)過分析后，得出幾點(diǎn)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素，如下：1.在消化過程中，消化時間，催化劑，濃硫酸都要一樣，一定要消化完全。在消化過程中蛋白質(zhì)附著在凱氏燒瓶壁上沒有被消化也會10/12word影響最終的濃度；2.蒸餾過程中，蒸餾出來的液體量一定要一樣，因?yàn)椴灰粯拥恼麴s水，最后結(jié)果不一樣，在蒸餾的過程中一開始要參加買的蒸餾水，蒸餾過程中參加的是自己用自來水蒸餾的。蒸餾中出氣孔的管子一定要插入硼酸液中定氮儀各連接處應(yīng)使玻璃對玻璃外套橡皮管絕對不能漏氣。參加消化液后加氫氧化鈉應(yīng)小心緩慢參加，開能常開，加完后加水液面以下，蒸餾過程中保證冷凝水一直在流動。蒸餾過程關(guān)甲不封；3.滴定過程中應(yīng)一滴一滴參加，滴定速度過快容易滴定過量。滴定過程中仰視刻度結(jié)果偏小，俯視刻度線結(jié)果偏大；4.蒸餾裝置的洗滌過程中洗滌不干凈也會導(dǎo)致誤差的出現(xiàn)；5.本實(shí)驗(yàn)方法適合測量0.05-3.0mg氮，含量過大應(yīng)該減少樣取量或者樣液稀釋。否如此會產(chǎn)生誤差；6.用量筒