植物細胞培養(yǎng)與次級代謝產(chǎn)物制備

植物細胞培養(yǎng)與次級代謝產(chǎn)物制備第1頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五第五章植物細胞培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模:小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)；根據(jù)培養(yǎng)方式:懸浮培養(yǎng)、單細胞培養(yǎng)等；根據(jù)要求產(chǎn)物:用于誘變的細胞培養(yǎng)和生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細胞培養(yǎng)。植物細胞培養(yǎng)（plantcellculture）是指在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養(yǎng)使其增殖獲得細胞或細胞產(chǎn)物的技術(shù)。第2頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五第一節(jié)植物細胞培養(yǎng)的特點植物細胞直徑一般約為10-200μm，平均直徑比微生物細胞大30-100倍。植物細胞通常以一定細胞數(shù)目的非均相細胞團方式存在于培養(yǎng)液中。植物細胞具有纖維素細胞壁和大的液泡，很容易被剪切力損傷。與微生物細胞相比，植物細胞生長速度慢，操作周期長，分批培養(yǎng)一般需要2-3周。第3頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜，適合微生物生長，因此防止污染更困難。植物細胞培養(yǎng)一般需要光照，通過光合作用合成有機物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對細胞培養(yǎng)影響較大。第4頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五與微生物細胞相比，植物細胞有什么特點？細菌，真菌、植物細胞都有細胞壁胞。細菌無成形的細胞核，真菌、植物細胞有成形的細胞核。細菌只有核糖體一種細胞器。植物細胞比微生物細胞大。生命活動與細胞分裂第5頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)技術(shù)

1、植物細胞培養(yǎng)基

無機鹽（大量、微量）

碳源（蔗糖）

有機氮源（水解酪蛋白）

有機酸、維生素

植物生長激素等第6頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五（1）單細胞分離1、酶解法選擇專一性水解酶在溫和的條件下將植物細胞壁物質(zhì)（纖維素果膠多糖）降解植物細胞壁物質(zhì)，從而使細胞彼此分開，這種方法稱為酶解法。經(jīng)常采用的生物酶包括：纖維素酶、果膠酶、瓊脂酶等生物酶。//機械法—外植體搗碎，然后過濾和離心。2、由植物培養(yǎng)組織（愈傷組織）中分離單細胞植物單細胞分離與小規(guī)模培養(yǎng)第7頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五酶解法Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞加果膠酶過濾、離心第8頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五由愈傷組織誘導(dǎo)分離單細胞莖段步驟：①誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；②愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；第9頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五搖床用于振蕩繼代懸浮③（Suspensionculture)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物120rpmculturetransfer1time/3d3weeks100-130目網(wǎng)過濾Centrifuge(離心）isolation第10頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五（2）植物單細胞小規(guī)模培養(yǎng)看護培養(yǎng)飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)細胞平板培養(yǎng)微室培養(yǎng)第11頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五看護培養(yǎng)

概念：用一塊愈傷組織或植物離體組織看護單細胞使其生長增殖的一種單細胞培養(yǎng)方法。第12頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五第13頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五飼養(yǎng)層培養(yǎng)

將飼養(yǎng)細胞先用射線輻射處理，使其失去活性，然后將飼養(yǎng)細胞和培養(yǎng)細胞混合植板，經(jīng)過照射的細胞對于培養(yǎng)細胞能夠起到一個飼養(yǎng)作用。第14頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五雙層濾紙植板培養(yǎng)方法培養(yǎng)基飼養(yǎng)層細胞看護濾紙層轉(zhuǎn)移碟濾紙培養(yǎng)細胞第15頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五第16頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五概念：將制備好的單細胞懸浮液，按照一定的細胞密度，接種在1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng)。

細胞平板培養(yǎng)法第17頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五微室培養(yǎng)

概念：人工制造一個小室，將單細胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法，稱微室培養(yǎng)。第18頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五第19頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五微室培養(yǎng)特點：

①能在顯微鏡下追蹤單細胞分裂增殖形成細胞團的全過程。

②培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH值變動幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。

第20頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五細胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。

同一培養(yǎng)體系中，細胞不同步使懸浮細胞的分裂、代謝以及生理、生化狀態(tài)等更趨復(fù)雜化，所以人們一直希望通過一定的技術(shù)途徑，使同一培養(yǎng)體系中的細胞能保持相對一致的細胞學(xué)和生理學(xué)狀態(tài)。細胞的同步化培養(yǎng)第21頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五①體積選擇法：用大、小孔徑篩網(wǎng)過濾、收集單細胞。②冷/低溫處理法：4℃低溫下處理幾天使細胞同步化后，再添加新的培養(yǎng)液培養(yǎng)。③饑餓法：控制營養(yǎng)液濃度，通過饑餓使細胞達到同步化，再添加營養(yǎng)液培養(yǎng)。④抑制法：使用抑制劑如尿苷、5-氟脫氧尿苷、秋水仙素等使細胞達到同步化。第22頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五無論何種細胞同步化處理，對細胞本身或多或少都有一定的傷害。如果處理的細胞沒有足夠的生活力，不僅不能獲得理想的同步化效果，還可能造成細胞的大量死亡，因此在進行同步化處理之前，細胞必須進行充分的活化培養(yǎng)。用于處理的細胞系最好處于對數(shù)生長期。第23頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五細胞系和細胞株細胞系和細胞株概念原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即稱為細胞系（CellLine），因此細胞系可泛指一般可以傳代的細胞。是以一種細胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群體。第24頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)細胞稱為細胞株（CellStrain），也就是說，細胞株是用細胞系單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。第25頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五細胞株篩選1、適合于工業(yè)化生產(chǎn)的細胞株必須滿足以下條件：（1）分散性好，適合大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。（2）均一性好，細胞大小、生理狀態(tài)一致。（3）生長速度快培養(yǎng)周期短不易染菌。（4）目標(biāo)產(chǎn)物含量高，容易分離提取。（5）細胞遺傳穩(wěn)定。2、適合工業(yè)生產(chǎn)用細胞株的一般篩選流程：（自學(xué)）3、細胞株定向富集馴化4、人工誘變篩選第26頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五

5、細胞株保存⑴繼代培養(yǎng)保存法懸浮培養(yǎng)的細胞通過每隔1—2周換液進行一次繼代培養(yǎng)。這種方法適合于短期保種。⑵低溫保存法一般選擇5--10℃的溫度下培養(yǎng)，每隔十天左右更換一次培養(yǎng)液。⑶冷凍保存包括低溫保存（-20℃）、超低溫保存（液氮-196℃）。第27頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)(cellsuspensionculture)

(1)細胞懸浮培養(yǎng)的概念和意義懸浮培養(yǎng)是將單個游離細胞或小細胞團懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。第28頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五意義/優(yōu)點細胞可以不斷增殖，形成高密度的細胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；能夠提供大量較為均勻的細胞，為研究細胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。第29頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五CellsuspensionPlantsArtificialseedsSecondaryproductsIsolationprotoplastsMutationselect細胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用第30頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五細胞懸浮培養(yǎng)起始培養(yǎng)物的建立選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素；必要的附加物質(zhì)。愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強。第31頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五建立細胞懸浮系第32頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五懸浮細胞的生長與增殖懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點：一是增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)；二是在振蕩條件下可避免細胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細胞自身產(chǎn)生毒害；三是振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換。第33頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五懸浮培養(yǎng)細胞數(shù)目的增殖變化第34頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五細胞生長各個時期的特點：

滯后期（延遲期）:細胞很少分裂，其長短與接種量、大小和繼代時原種細胞所處的生長期有關(guān)；

對數(shù)生長期:細胞分裂活躍，細胞數(shù)目增加，增長速率保持不變

直線生長期:細胞生長和發(fā)育最明顯的時期

緩慢期:生長逐漸緩慢,培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增多，氧氣減少；

靜止/平臺期:生長幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。

衰亡期：細胞死亡速度加快，細胞開始快速自溶，死亡。

第35頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件：懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天甚至更短時間便可增加一倍。第36頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五影響懸浮細胞生長的因素：

起始愈傷組織的質(zhì)量：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎。

接種細胞密度：接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長，懸浮細胞的起始密度一般在0.5～2.5×105個細胞/毫升，低于這一密度則會使細胞生長延遲。

培養(yǎng)條件：方式、溫度、繼代周期第37頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器—自學(xué)生物反應(yīng)器是指用于高等生物細胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。機械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)氣升式反應(yīng)器鼓泡式反應(yīng)器第38頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)，根據(jù)一個培養(yǎng)周期中是否添加培養(yǎng)基，可分為成批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)方式等。成批培養(yǎng)（batchculture）:指在一個培養(yǎng)體積中，接種細胞和添加培養(yǎng)基后，中途不添加培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方式。植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)方式第39頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）:在培養(yǎng)過程中，不斷地向反應(yīng)器中添加培養(yǎng)基，同時以相同的流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)液，從而維持培養(yǎng)系統(tǒng)的內(nèi)在細胞密度、產(chǎn)物濃度以及物理狀態(tài)相對平衡的培養(yǎng)方式。半連續(xù)培養(yǎng)（semi-continuousculture）:這是一種介于成批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)之間的培養(yǎng)方式，其基本方法是在完成上述成批培養(yǎng)的一個周期后，只從反應(yīng)器中取出大部分細胞懸液，保留小部分細胞懸液作為下一個培養(yǎng)周期的種子細胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。第40頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五?植物細胞固定化需要采用固定劑，是一些多糖和多聚類化合物，常用的包括海藻酸鹽、瓊脂糖、卡拉膠等。1、海藻酸鹽固定化在Ca2+離子等多價陽離子的存在下，海藻酸鹽的羧基和Ca2+之間以離子鍵形成不溶于水的海藻酸鈣，從而在細胞表面形成凝膠。如果采用磷酸、檸檬酸、EDTA等螯合劑處理將Ca2+離子除去，又能使膠體溶解釋放出細胞。無菌空氣入口玻璃瓶細胞和褐藻酸鈉混合液 空氣出口形成膠體顆粒的噴射口 隔濾板裝有CaCl2溶液的燒瓶

植物細胞固定化方法海藻酸鹽固定化細胞步驟第41頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五

常用方法：（1）滴入法：將細胞懸浮液與滅菌的含NaCl的卡拉膠溶液混勻，然后滴入含中KCl的培養(yǎng)基中，使其分散成小顆粒。過濾、清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。（2）模鑄法：將細胞-卡拉膠溶液注入柱形鑄模中形成顆粒。（3）兩相法：將細胞-卡拉膠溶液與無菌豆油或石蠟油攪拌混勻，形成液滴置于冰浴中不斷攪拌，凝固成均勻顆粒，再離心除去油相和大部分溶液。2、卡拉膠固定化第42頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五

瓊脂糖(Agarose)固定化：（1）凝塊法：將細胞懸浮于滅菌的瓊脂糖中，攪拌待凝結(jié)包埋細胞后，將凝塊擠進無菌金屬網(wǎng)中，使其分散成小顆粒。清洗顆粒后轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。（2）模鑄法：同卡拉膠法（3）兩相法：同卡拉膠法

優(yōu)點：與海藻酸鹽、卡拉膠等固定化方法相比，不需要其它離 子來保證膠的穩(wěn)定性。

不足：制得的顆粒較大、形狀不規(guī)則。3、瓊脂糖(Agarose)固定化第43頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五

固定化后需要測定細胞存活率大小，方法有：（1）熒光染色觀察法：根據(jù)活細胞對FDA（二乙酸熒光素）黃綠色熒光染料能被吸收，而死細胞無法吸收原理鑒定。（2）呼吸強度測定：

用氧電極法測定固定化細胞的呼吸強度判斷存活率。（3）細胞生長速率的測定：

通過測定細胞的濕重或干重增加率反映細胞活性大小。固定化細胞活力測定第44頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物概述培養(yǎng)系統(tǒng)植物細胞規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)要點提高細胞次生代謝產(chǎn)物的途徑細胞規(guī)模化培養(yǎng)中的有關(guān)技術(shù)問題第45頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五概述長期以來，植物一直是許多化學(xué)品的主要資源，特別在制藥和食品加工業(yè)中更是不可缺少；據(jù)不完全統(tǒng)計，至少有20%左右的藥物是由植物衍生而來，而且每年都有發(fā)現(xiàn)許多植物來源的新化合物。第46頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五細胞代謝產(chǎn)物分為初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物。初級代謝產(chǎn)物（Primarymetabolites）是通過初級代謝產(chǎn)生的維持細胞生命活動必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類等。次級代謝產(chǎn)物（Secondarymetabolites）是指植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。植物次生代謝產(chǎn)物次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。第47頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五不同種類的生物所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物不相同，它們可能積累在細胞內(nèi)，也可能排到外環(huán)境中。由于次級代謝產(chǎn)物大多具有生物活性，因此是植物代謝產(chǎn)物研究的重點。第48頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五

由于資源短缺和需求量增加，依靠從栽培植物提取天然的次級代謝產(chǎn)物途徑很難滿足人類需求，而利用植物細胞生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物成為最有效途徑。優(yōu)點：減少耕地占用，不受季節(jié)、地域限制；可以排除病菌和害蟲的影響(密閉無菌操作)；可通過選擇優(yōu)良株系和優(yōu)化培養(yǎng)條件提高代謝物產(chǎn)量；能通過改造生物合成途徑獲得新有用物質(zhì)。第49頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義

李時珍（1593）在《本草綱目》中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25％的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。

第50頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五1、藥用代謝產(chǎn)物

這是重要應(yīng)用領(lǐng)域，包括生物堿、萜類、苷類、酮類等。例如，紫杉醇（Taxol）是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種二萜烯類化合物，治療乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的藥物。通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有價值的次生代謝產(chǎn)物需求：僅美國每年就有50000名婦女患卵巢癌，每年需約24kg紫杉醇；還有約40000名婦女死于乳腺癌，年需求量將增至100kg。全世界每年需要500kg紫杉醇才能滿足廣大癌癥患者需求。生產(chǎn)1kg紫杉醇需要砍伐60年生大樹3000-4000棵。紫杉醇在樹皮、嫩芽中含量最高。若光從樹皮中提取紫杉，每年需砍伐150-200萬棵左右的大樹。第51頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五2、天然食品和食品添加劑

如胡蘿卜素、葉黃素、甜菊苷、辣椒素等，因為化學(xué)合成色素和甜味劑越來越受到擔(dān)心和嚴格限制。3、殺蟲劑和殺菌劑如利用萬壽菊細胞生產(chǎn)噻吩烷，香草生產(chǎn)魚藤酮殺蟲劑。4、飼料、精細化工等產(chǎn)品如用培養(yǎng)的槡、榆等細胞，再加入大豆粉、糖、淀粉等可充足供應(yīng)蠶養(yǎng)殖業(yè)的飼料。精細化工產(chǎn)品種類繁多（36類），附加值高，具有功能性或最終使用性。除上述醫(yī)藥、農(nóng)藥、添加劑外，還包括染料、涂料、香精、洗滌劑、化妝品、金屬表面處理劑、芳香消臭劑等產(chǎn)品。第52頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五產(chǎn)品成分用途年銷售額/億美元長春花堿（長春花）治療白血病18～20（美國）阿嗎靈循環(huán)系統(tǒng)障礙藥5～25（全世界）奎寧（金雞納樹）治療瘧疾5～10（美國）致熱素殺蟲劑20（全世界）毛地黃心臟病藥20～55（美國）第53頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五

植物次級代謝產(chǎn)物的生物合成聚酮途徑：又稱乙酸丙二酸途徑，乙酰輔酶A通過直線式聚合生成脂肪酸和環(huán)狀次級代謝產(chǎn)物。聚酮類化合物的合成。莽草酸途徑：生物堿、類黃酮、香豆素等產(chǎn)物。甲戊二羥酸途徑：又稱甲瓦龍酸途徑，合成萜類、甾體、蒽醌等產(chǎn)物。第54頁，共60頁，2023年，2月20日，星期五（1）細胞株植物不同部位的細胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力是不同的，所以在進行植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有價值的代謝產(chǎn)物時，必須弄清楚產(chǎn)物的合成部位，也就是應(yīng)該考慮到不同部位來源細胞的特性。篩選出穩(wěn)定、高產(chǎn)、生長速度快的細胞株是細胞大規(guī)模培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物的前提。缺乏適合的細胞株是目前許多代謝產(chǎn)物無法利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的主要限制之一。細胞遺傳特性植物次級代謝產(chǎn)物合成