雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體

雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體第1頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五單克隆抗體（McAb）：是由只識(shí)別單一抗原決定簇的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。

理化性狀高度均一效價(jià)高只與一種抗原表位發(fā)生反應(yīng)、生物活性單一具有高度特異性又易于大量制備第2頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五如何獲得McAb?如何大量獲得McAb?需要克服哪些技術(shù)問(wèn)題？第3頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五理想的抗體分泌細(xì)胞：具有合成和分泌抗體的能力

具有大量無(wú)限生長(zhǎng)的特性第4頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

在1975年，Kohler和Milstein將來(lái)源于小鼠骨髓的骨髓瘤細(xì)胞和嚙齒動(dòng)物可以分泌抗體的細(xì)胞融合后形成雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖的能力，也具有免疫細(xì)胞分泌抗體的能力，后來(lái)將這種雜交細(xì)胞系統(tǒng)統(tǒng)稱為雜交瘤（hybridoma）。

通過(guò)篩選，分離得到針對(duì)特異性抗原并具有所要求的抗體親和力的雜交瘤細(xì)胞。在適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)條件下，雜交瘤細(xì)胞能夠生長(zhǎng)和無(wú)限制性傳代，并且能產(chǎn)生大量單一類型的抗體及單克隆抗體。第5頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五一、雜交瘤技術(shù)的基本原理二、單克隆抗體的制備三、單克隆抗體的應(yīng)用第6頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

一雜交瘤技術(shù)的基本原理

利用聚乙二醇作為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與具有在體外不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一

體，在HAT選擇性培養(yǎng)基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選和單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)（克隆化）,最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體,又能不斷繁殖的雜交瘤

細(xì)胞系，將這種細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其產(chǎn)生的腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體。第7頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五流程雜交瘤技術(shù)第8頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，可溶性抗原10-50ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔，2-4周后加強(qiáng)免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復(fù)多次）沖擊免疫（融合前3天進(jìn)行）選用6-12周齡Balb/c小鼠免疫方案第9頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同小鼠骨髓瘤細(xì)胞第10頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五處于免疫狀態(tài)脾臟中的B淋巴母細(xì)胞或漿母細(xì)胞動(dòng)物：6～12周齡20g～25g體重免疫脾細(xì)胞第11頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：不同的分子質(zhì)量、濃度、作用時(shí)間、pH,可能直接影響融合效果細(xì)胞融合第12頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞1-2×107免疫脾細(xì)胞的制備：1-2×108無(wú)菌手術(shù)第13頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五飼養(yǎng)細(xì)胞：常用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，5-8×106分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子吞噬衰老細(xì)胞和微生物存活一般不超2周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化第14頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞DNA合成途經(jīng)：1.替代途徑：次黃嘌呤（H）HGPRT2.主要途徑：氨基酸鳥嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（T）第15頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成DNAHAT選擇培養(yǎng)基的原理第16頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五HAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻第17頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第18頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五克隆化：指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開。克隆化的原則：盡早進(jìn)行，反復(fù)4-5次陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化第19頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五有限稀釋法(limitingdilution)軟瓊脂平板法(softagarmethod)單細(xì)胞顯微操作法(micromanipulation)熒光激活細(xì)胞分類法法（fluorescenceactivatedcellsorter，F(xiàn)ACS）克隆化方案：第20頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞有限稀釋法第21頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五在沒(méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞污染，分泌抗體能力喪失等“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇第22頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡細(xì)胞冷凍的意義第23頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五雜交瘤細(xì)胞檢定1.抗體分泌穩(wěn)定性抗體連續(xù)傳代法---保持穩(wěn)定分泌特異性抗體2.細(xì)胞核學(xué)特征檢查細(xì)胞分裂中期染色體---保證不丟失產(chǎn)生抗體基因的染色體3.鼠源病毒檢查細(xì)胞試驗(yàn)，動(dòng)物抗體產(chǎn)生試驗(yàn)，雞胚感染試驗(yàn)等---排除單抗制品的病毒污染4.支原體檢查熒光染色法，培養(yǎng)法，分子生物學(xué)法等—防止污染5.無(wú)菌試驗(yàn)直接接種法，薄膜過(guò)濾法第24頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

二單克隆抗體的制備

經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。第25頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：

操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)主要用于生產(chǎn)科研或診斷用單抗腹水濃度可達(dá)2-5mg/ml實(shí)體瘤法、腹水制備法體外培養(yǎng)法：使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞工藝簡(jiǎn)單、易控制，可大規(guī)模生產(chǎn)濃度不高，200-500ug/ml懸浮培養(yǎng)法、固相培養(yǎng)法單克隆抗體的產(chǎn)生第26頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五腹水制備法第27頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五預(yù)先腹腔注射降直烷或液狀石蠟1-2周后注射（1～5）×106細(xì)胞1～3w形成腹水5-20mg/ml,1-10ml高滴度腹水第28頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗體特異性鑒定：抗原類似物的交叉反應(yīng)Ig類型、亞類鑒定：雙擴(kuò)法或ELISA法McAb中和活性鑒定：動(dòng)物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)McAb識(shí)別抗原表位測(cè)定：用競(jìng)

爭(zhēng)結(jié)合法，測(cè)相加指數(shù)法McAb親和力測(cè)定：ELISA單克隆抗體性質(zhì)鑒定第29頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五注意事項(xiàng)1.污染細(xì)菌，真菌，支原體2.雜交瘤細(xì)胞不分泌或停止分泌抗體HAT中A失效；免疫原的抗原性弱，免疫效果差；支原體污染；抗體非分泌細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)；染色體丟失第30頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五預(yù)防措施1.大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管；2.倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；3.不讓細(xì)胞“過(guò)度生長(zhǎng)”4.不讓培養(yǎng)物不加檢查任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾月；第31頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五抗體的純化：硫酸銨沉淀凝膠過(guò)濾法離子交換層析親和層析第32頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五硫酸銨沉淀

大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出血清50%飽和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）33%飽和度硫酸胺上清沉淀擬球蛋白r球蛋白第33頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五凝膠過(guò)濾法干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠柱上進(jìn)行洗脫時(shí)，大分子蛋白不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動(dòng)較慢洗脫出來(lái)較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來(lái)。交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)瓊脂糖凝膠(Sepharose)第34頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五離子交換層析法DEAE纖維素：結(jié)合溶液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，又稱陰離子交換劑CM纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，又稱陽(yáng)離子交換劑第35頁(yè)，共38頁(yè)，2023年，2月20日，星期五親和層析法將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復(fù)合