生化3第三章核酸化學(xué)課件

第三章核酸化學(xué)NucleicAcidchemistry1.核酸的化學(xué)組成結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)2.核酸的測定方法3.核酸的研究技術(shù)4.了解人類基因組計劃重點：1.RNA.DNA一級結(jié)構(gòu)的測定原理與方法2.雙螺旋結(jié)構(gòu)要點，三葉草結(jié)構(gòu)要點3.核酸研究的常用技術(shù)及應(yīng)用4.核酸含量的測定原理與方法難點：1.DNA一級結(jié)構(gòu)測定的原理與方法2.核苷酸的兩性離解3.雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點教學(xué)目的1868年，F(xiàn).Miescher從細胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。and可分離mRNA(5%)真核tRNA(10-15%)rRNA（80%）SnRNA(核內(nèi)）sRNASnoRNA(核仁）RNAmRNAScRNA(胞內(nèi))原核tRNArRNA病毒：RNA病毒核酸的功能1、DNA是遺傳信息的載體2、RNA的功能參與遺傳與進化參與蛋白質(zhì)的生物合成參與RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾參與基因表達調(diào)節(jié)催化等第一節(jié)核酸的組成成分一.元素組成CHONP(9%-9.9%)核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖嘌呤嘧啶核糖脫氧核糖核酸酶核苷酸酶核苷酶鳥嘌呤腺嘌呤尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶RNA:P-9%,DNA:P-9.9%核酸的組成單位：核苷酸核酸的組成成分：堿基，戊糖，磷酸二.組成成分及組成單位（二）、堿基1.嘌呤（Purine）堿123456978腺嘌AdenineA鳥嘌呤guanineG嘌呤（Purine）2.嘧啶（Pyrimidine）堿嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶uracilU胞嘧啶CytidineCTH3C胸腺嘧啶Thy(三)、核苷（nucleoside）核苷戊糖+堿基糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)5OH假尿苷（ψ）次黃苷（肌苷）I黃嘌呤核苷X二氫尿嘧啶核苷D取代核苷的表示方式7-甲基鳥苷m7G（四）、核苷酸（nucleotide）H（五）.核苷酸衍生物1.繼續(xù)磷酸化AMPADPATP3.環(huán)化磷酸化

cAMP

cGMP4.肌苷酸及鳥苷酸(強力味精)IMPGMP第二節(jié)、RNA的分子結(jié)構(gòu)一、RNA的一級結(jié)構(gòu)（一）連接方式5’5’3’3’5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′

ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OH5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羥基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個多聚核苷酸鏈時，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。多聚核苷酸的表示方式DNARNA二、RNA的降解1、RNA的化學(xué)降解堿降解：RNA用稀堿降解產(chǎn)物為2’-核苷酸和3’-核苷酸混合物。DNA抗堿(高溫不抗堿)酸降解：水解速度嘌呤糖苷鍵>嘧啶糖苷鍵脫氧核糖糖苷鍵>核糖糖苷鍵糖苷鍵>脂鍵在低溫的酸性條件下DNA，RNA則穩(wěn)定2.酶法降解核酸酶有:外切酶，內(nèi)切酶和磷酸酯酶牛胰RNaseI產(chǎn)物：3’-嘧啶核苷酸（結(jié)尾）內(nèi)切酶RnaseT1產(chǎn)物：3’-鳥嘌呤核苷酸（結(jié)尾）RnaseU2產(chǎn)物：3’-嘌呤核苷酸（結(jié)尾）SPDase(牛脾)5’-端開始，產(chǎn)物：3’-核苷酸外切酶VPDase(蛇毒)3’-端開始，產(chǎn)物：5’-核苷酸磷酸單酯酶（PNase）5’-磷酸（二）酶的部分降解及產(chǎn)物的分離1、尿素柱層析2、雙向電泳3、凝膠電泳（一）RNA的二級結(jié)構(gòu)四.RNA的高級結(jié)構(gòu)占RNA總量的15％一種氨基酸對應(yīng)最少一種RNA分子量25000左右，大約由70－90個核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左右。分子中含有較多的修飾成分。3'-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)。1.特點2.三葉草結(jié)構(gòu)要點（二）tRNA的三級結(jié)構(gòu)第三節(jié)DNA的分子結(jié)構(gòu)一、DNA的一級結(jié)構(gòu)及測定1.加減法2.雙脫氧法3.化學(xué)修飾法二.DNA的二級結(jié)構(gòu)2.0nm小溝大溝

雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù)類型旋轉(zhuǎn)方向結(jié)晶狀態(tài)螺旋直徑（nm）螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基對數(shù)目堿基對間垂直距離（nm）堿基旋轉(zhuǎn)角度A－DNAB－DNAC-DNAz－DNA右75%Na+右92%Na+右66%Li+左人工合成2.02.31.921.82.83.43.14.511109.3120.2550.340.330.2732.7o36o38o-60oH-DNA三、DNA的三級結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋的進一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)，負超螺旋

原核雙鏈環(huán)狀DNA（dcDNA）病毒單鏈環(huán)狀DNA（scDNA）單鏈線性DNA（ssDNA）第四節(jié)核酸及核苷酸的性質(zhì)一、溶解性DNA在PH4.2時溶解度最低。RNA在PH2-2.5時溶解度最低。1.水溶性微溶于水，不溶于有機溶劑,水中溶解度DNA達2%，RNA達4%2.鹽溶性DNA-蛋白，溶于1mol/LNacl，低鹽不溶。RNA-蛋白，溶于0.14mol/LNacl，高鹽不溶。3.不同PH的溶解性二.兩性性質(zhì)1.腺嘌呤2.鳥嘌呤:4.尿嘧啶胸腺嘧啶3.胞嘧啶核苷酸兩性離解及等電點三、核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。以A260/A280進行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光四、核酸的變性與復(fù)性（一）.變性變性:穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。變性表征:生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）變性因素:

pH（>11.3或<5.0）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛），低離子強度加熱熱變性和Tm:DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44（二）.核酸的復(fù)性變性核酸的互補鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為“退火”。退火溫度＝Tm－25℃復(fù)性影響因素片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/純度/溶液離子強度第五節(jié)核酸及其組分的分離純化與測定一.分離純化的一般原則1.防止核酸酶降解2.防止化學(xué)因素降解3.防止物理因素降解二.DNA的分離純化三.RNA的分離純化四.核酸組分的分離純化

破細胞（1mol/LNACL）

離心去沉淀（含RNA-Pr）上清（含DNA-Pr）SDS法/酚法（去蛋白）離心去沉淀（變性蛋白）上清（含DNA）乙醇沉淀離心收集沉淀（DNA）

細胞（飽和酚處理）離心去沉淀（含DNA-Pr）上清液調(diào)節(jié)PI（RNAPI）離心去上清收集沉淀（總RNA）不同的RNA分離時可用：DEAE-Sephadex超離心Olig-dt親和層析1.離子交換法：四種核苷酸之間的分離采用離子交換法陽離子交換劑洗脫次序：理論次序

UGAC實際次序UGCA陰離子交換劑洗脫次序：理論次序CAGU實際次序CAUG2.凝膠過濾法:堿基,核苷,核苷酸之間的分離采用Sephadex-G10/G25洗脫次序：核苷酸核苷堿基核苷一磷酸,核苷二磷酸,核苷三磷酸的分離采用柱層析和薄層層析法分離.柱層析洗脫次序AMPADPATP薄層層析遷移次序AMPADPATP3.DEAE-纖維素法:

五.核酸及其組分含量的測定與純度測定（一）.核酸含量的測定方法1.紫外吸收法1ug/mlDNAA260=0.021A260=50Ug/mlDNA1ug/mlRNAA260=0.022-0.0241A260=40Ug/mlRNA2.定糖法(20-250ugRNA,40-400ugDNA)苔黑酚法：苔黑酚+核糖+濃HCl+FeCl3綠色A670-680二苯胺法：二苯胺+脫氧核糖+濃H2SO4藍色A595-6203.定磷法(10-100ug核酸)4.凝膠電泳EB(0.5ug/ml)染色,最小檢出量1ngVitCH3PO4+鉬酸銨黃色磷鉬酸銨磷鉬藍A650-660（二）.核酸純度的測定1.紫外吸收法測定A260與A280A260A280=1.8-2.0DNA:2.凝膠電泳3.等密度梯度≥2.0RNA:A260A280第六節(jié)核酸研究的常用技術(shù)一.DNA的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖凝膠濃度及選擇2.瓊脂糖凝膠電泳的分辨率3.瓊脂糖凝膠電泳的用途(分離,測量,回收,印跡)（二）PAGE電泳1.PAGE濃度及選擇2.PAGE電泳的分辨率3.PAGE電泳的用途（三）影響凝膠電泳Rf值的因素1.分子大小2.分子構(gòu)象3.凝膠濃度4.電流電壓5.溫度二.印跡技術(shù)與分子雜交（一）.印跡技術(shù)概念:核酸的雜交中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA/RNA分子，雜交之前通過毛細管吸附作用/電導(dǎo)作用將凝膠中DNA/RNA分子原封不動地轉(zhuǎn)移到濾膜上。濾膜:硝酸纖維素濾膜，DEAE-纖維素濾膜印跡種類:Southernblotting:（1975）Northernblotting:（1979，Alwine)（1979，Towbin,Immunoblotting-Western;1982,Reihart,Eastern)電轉(zhuǎn)移技術(shù):(1983,Aubertin)（二）.核酸雜交核酸雜交的概念:DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。核酸雜交方法：Southernblotting雜交技術(shù):Northernblotting雜交技術(shù):點雜交技術(shù):菌落/噬菌體的原位雜交技術(shù):（三）.雜交檢測方法—放射自顯影點雜交三.PCR技術(shù)-DNAPolymeraseChainReaction（一）基本步驟引物1pmol/ul,dNTP200umol/l,Taq酶2u/100ul94?c5-10min褪火45s-60s保溫72?c1min（二）PCR技術(shù)的應(yīng)用1.遺傳病，疑難病的診斷及產(chǎn)前檢查2.病原體的檢測3.癌基因的檢查4.基因組測序5.基因探針的制備6.基因突變的分析及定位誘變7.cDNA庫的構(gòu)建,DNA重組,基因分離與克隆8.法醫(yī)及刑事鑒定（三）PCR技術(shù)的特點1.引物設(shè)計:(引物的長度一般為18～25bp)擴増長度一般在200～800bp之間2.擴増效率:2n,DNA量增加106～109倍3.擴増溫度:G＋C含量和Tm值,一般在40－60%之間，兩條相差2－3℃,72℃.4.末端核苷酸:3’端不得