專題基因工程的基本操作程序課件

理解教材新知專題11.2把握熱點考向應(yīng)用創(chuàng)新演練知識點一知識點三考向一考向二考向三知識點二[自讀教材·夯基礎(chǔ)]1．目的基因

(1)主要是指

的基因。

(2)也可以是一些具有

的因子。

2．獲取方法

(1)從基因文庫中獲?。孩倩蛭膸斓暮x：將含有某種生物不同基因的許多

，導(dǎo)入

的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因。編碼蛋白質(zhì)調(diào)控作用DNA片段受體菌(2)利用PCR技術(shù)擴增目的基因：①原理：

。②前提條件：有一段已知目的基因的

，以便根據(jù)這一序列合成

。③條件：DNA模板、

、

和4種脫氧核苷酸。DNA復(fù)制核苷酸序列引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶引物④擴增過程：受熱引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶（3）1．探討基因文庫、基因組文庫、cDNA文庫之間的關(guān)系。

提示：基因組文庫含有一種生物的全部基因，而cDNA文庫只含有一種生物的部分基因，二者都是基因文庫。

2．從酶的角度分析PCR技術(shù)擴增DNA與DNA體內(nèi)復(fù)制的不同點。

提示：①PCR技術(shù)擴增DNA不需要解旋酶；②PCR技術(shù)需要的DNA聚合酶應(yīng)具有熱穩(wěn)定性。[跟隨名師·解疑難]1．提取目的基因方法的比較方法基因文庫的構(gòu)建PCR技術(shù)擴增人工合成基因組文庫部分基因文庫(如cDNA文庫)過程供體細胞中的DNA

↓限制酶許多DNA片段

↓連接表達載體↓導(dǎo)入受體細胞↓外源DNA擴增，產(chǎn)生特定性狀↓分離目的基因目的基因的mRNA

↓反轉(zhuǎn)錄單鏈DNA↓合成雙鏈DNA↓插入載體↓導(dǎo)入受體菌群(cDNA文庫)↓分離目的基因目的基因DNA

高溫解鏈單鏈DNA

與引物結(jié)合、DNA聚合酶大量目的基因蛋白質(zhì)的氨基酸序列↓推測mRNA的核苷酸序列↓推測基因的核苷酸序列

化學合成目的基因2．PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋場所細胞內(nèi)(主要在細胞核內(nèi))細胞外(主要在PCR擴增儀內(nèi))酶DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐熱的DNA聚合酶(Taq聚合酶)溫度條件細胞內(nèi)溫和條件需控制溫度，在較高溫度下進行合成的對象DNA分子DNA片段或基因聯(lián)系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質(zhì)合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸[特別提醒](1)基因工程操作中，只有使用受體生物自身基因的啟動子才比較有利于基因的表達。

(2)通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細胞中無法轉(zhuǎn)錄。

(3)熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq聚合酶)能在高溫下保持其活性，是PCR技術(shù)關(guān)鍵的工具之一。[自讀教材·夯基礎(chǔ)]1．基因表達載體的構(gòu)建

(1)目的：使目的基因在受體細胞中

，并且可以遺傳和

。

(2)組成：穩(wěn)定存在表達(3)導(dǎo)入微生物細胞：①原核生物特點：

、多為

、遺傳物質(zhì)相對

等。②方法：感受態(tài)細胞法，即用

處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細胞稱為

)。繁殖快單細胞Ca2＋較少感受態(tài)細胞1．思考基因表達載體的構(gòu)建需要哪些工具酶。提示：限制酶、DNA連接酶。

2．結(jié)合教材P13資料卡分析，用花粉管通道法導(dǎo)入受體細胞的目的基因是否需要和載體結(jié)合？試分析原因。提示：需要。因為目的基因只有和載體結(jié)合成基因表達載體才容易在受體細胞中穩(wěn)定維持和表達。

3．為什么動物的體細胞不能作為受體細胞？提示：動物體細胞全能性受到限制，不能發(fā)育為一個新個體。[跟隨名師·解疑難]1．基因表達載體的構(gòu)建過程將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成一個重組DNA分子(重組質(zhì)粒)。構(gòu)建過程如圖所示：[特別提醒](1)完成基因表達載體的構(gòu)建，需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，連接產(chǎn)物有目的基因—目的基因，目的基因—運載體和運載體—運載體三種。

(2)將基因表達載體(重組質(zhì)粒)導(dǎo)入農(nóng)桿菌的常用方法是Ca2＋處理法。Ca2＋(或CaCl2溶液)對微生物細胞的作用是增加細胞壁的通透性。[自讀教材·夯基礎(chǔ)]1．分子水平的檢測(連線)2．個體水平的鑒定(1)

的接種實驗。(2)對基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進行

?？瓜x或抗病活性比較

1．檢測棉花中導(dǎo)入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是什么？提示：用葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡。

2．DNA分子雜交的原理是什么？有哪些應(yīng)用？提示：堿基互補配對原則?？捎糜谟H子鑒定、刑事偵查、生物親緣關(guān)系確定等。

[例1]為從根本上解決水稻中的高植酸問題，可將植酸酶基因?qū)胨荆嘤椭菜徂D(zhuǎn)基因水稻品種。下圖是獲取植酸酶基因的流程。(2)表達：只有編碼區(qū)能轉(zhuǎn)錄生成RNA，且內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分要剪切掉，即轉(zhuǎn)錄生成的mRNA只有外顯子對應(yīng)部分。因此，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的目的基因中沒有內(nèi)含子、啟動子和終止子。下列關(guān)于cDNA文庫和基因組文庫的說法中，不正確的是(

)A．cDNA文庫中的DNA來源于mRNA的反轉(zhuǎn)錄過程B．如果某種生物的cDNA文庫中的某個基因與該生物的基因組

文庫中的某個基因控制的性狀相同，則這兩個基因的結(jié)構(gòu)

也完全相同C．cDNA文庫中的基因都沒有啟動子D．一種生物的cDNA文庫可以有許多種，但基因組文庫只有一

種解析：由于基因轉(zhuǎn)錄時只有編碼區(qū)段才能轉(zhuǎn)錄，所以以mRNA反轉(zhuǎn)錄成的DNA就只有外顯子區(qū)段，而缺少內(nèi)含子和啟動子等非編碼區(qū)段，和原來的基因結(jié)構(gòu)不相同。答案：B.[例2]右圖為某種質(zhì)粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點，ampr為青霉素抗性基因，tetr為四環(huán)素抗性基因，P為啟動子，T為終止子，ori為復(fù)制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在內(nèi)的多種酶的酶切位點。據(jù)圖回答：

(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進行連接后，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有________________、________________、__________________三種。

(2)用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉(zhuǎn)化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產(chǎn)物有________________；若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產(chǎn)物有____________。(3)目的基因表達時，RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點是________，其合成的產(chǎn)物是________。

(4)在上述實驗中，為了防止目的基因和質(zhì)粒在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應(yīng)選用的酶是________________。[思路點撥][精講精析]

(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用EcoRⅠ酶切，所產(chǎn)生的黏性末端相同，用DNA連接酶處理后，不同的片段隨機結(jié)合，可形成3種不同的連接物：目的基因—目的基因、目的基因—運載體、運載體—運載體。

(2)在上述三種產(chǎn)物中，插入目的基因的都不能在四環(huán)素培養(yǎng)基上生長，只有運載體—運載體連接產(chǎn)物才能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長。

(3)啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點，可啟動轉(zhuǎn)錄過程，合成mRNA。

(4)由圖示和題目中提供的信息可知，同時運用EcoRⅠ和BamHⅠ進行酶切可有效防止酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接。[答案]

(1)目的基因—載體連接物載體—載體連接物目的基因—目的基因連接物

(2)載體—載體連接物目的基因—載體連接物、載體—載體連接物

(3)啟動子mRNA(4)EcoRⅠ和BamHⅠ(1)切割目的基因和運載體時并非只能用一種酶，但無論用幾種酶，一般都用相同種類的酶切割目的基因和運載體。

(2)啟動子≠起始密碼，終止子≠終止密碼。啟動子和終止子位于基因結(jié)構(gòu)的非編碼區(qū)，起始密碼和終止密碼位于mRNA上。[例3]

農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。下面是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的示意圖，試回答下列問題：(4)植物基因工程中將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法除了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法之外，還可采取的方法是_______。(至少寫出兩種)[思路點撥][精講精析]

(1)一般農(nóng)桿菌不能感染的植物是單子葉植物，可感染雙子葉植物和裸子植物，利用其感染性，可實現(xiàn)將目的基因?qū)胫参锛毎?。這里需要特別明確的是真正可轉(zhuǎn)移到受體細胞并整合到受體細胞的染色體上的是農(nóng)桿菌質(zhì)粒上的T-DNA片段，因此目的基因必須插入到該部位才能導(dǎo)入成功。(2)根據(jù)T-DNA這一轉(zhuǎn)移特點，可以推測出DNA片段上能