分子生物學的基本操作課件

第一章分子生物學的基本操作分子生物學研究從20世紀中葉開始高速發(fā)展的最主要原因——現(xiàn)代分子生物學研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點突變PCR擴增基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達?；蚬こ碳夹g(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征：具有跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關(guān)系的新的寄主生物細胞之中的能力。外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達的過程.1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細菌實驗2.50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescriptionofthestructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。JacobandMonod兩大技術(shù)保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’限制酶的發(fā)現(xiàn)——細菌的限制與修飾現(xiàn)象重組DNA實驗中常見的主要工具酶酶

類功

能限制性核酸內(nèi)切酶(II型)識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進行末端標記實驗或用來進行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團1972-PaulBerg,ProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組遠不能滿足基因研究的需要。DNA片段在體外不具備自我復制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細胞中進行繁殖。這就是基因克隆，或分子克隆。從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效地吸收λ噬菌體DNA。1972年，Cohen等人又報道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies表明：

（1）像pSC101這樣的質(zhì)粒DNA分子可以作為基因克隆的載體，從而把外源DNA導入寄主細胞；（2）像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細胞中并實現(xiàn)其功能表達；（3）質(zhì)粒DNA-大腸桿菌細胞作為一種成功的基因克隆體系，有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。

所謂細菌轉(zhuǎn)化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細菌菌株則被稱為受體菌株。1.2細菌轉(zhuǎn)化1.將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。感受態(tài)細胞制備及細菌轉(zhuǎn)化步驟：處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞。4.在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達、細胞活性恢復。3.立即將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。2.Ca2+與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞表面的復合物。5.涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。5.將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關(guān)系。1.3基因擴增聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)，即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。基本原理

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由高溫變性—低溫退火—適溫延伸三個基本反應步驟構(gòu)成，經(jīng)多個循環(huán)，理論上靶DNA分子將呈現(xiàn)指數(shù)性擴增。PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的互補

鏈。Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR儀1.4

核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎，受到科學界的高度重視。

基本原理

一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子同介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此，根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場當中，它們就會向正電極的方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。大分子量的DNA移動的慢小分子量的DNA移動的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間稱樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序取樣點樣電泳檢測結(jié)果檢測:溴化乙錠（ethidiumbromide，簡稱EtBr）染色，紫外觀察。在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。1.5

基因工程載體

1.至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。

2.

至少應有一個克隆位點，以供外源DNA插入。

3.

至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞

4.安全性大腸桿菌載體pBR322結(jié)構(gòu)圖

載體特點基因工程載體是一類可供外源DNA插入并攜其進入適當宿主細胞且能自主復制的DNA分子。1.5.1

質(zhì)粒DNA及其分離細菌質(zhì)粒是存在于細胞質(zhì)中的一類獨立于染色體并能自主復制的遺傳成份。絕大多數(shù)的質(zhì)粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復制子，也有線性質(zhì)粒的報道。質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，也可能在一定的條件下被可逆性整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

E．coli的質(zhì)粒種類

1)colE1因子（大腸桿菌素因子）—多數(shù)不能進行接合轉(zhuǎn)移DNA，屬高拷貝松弛型。

2)R因子（抗藥性因子）

可接合轉(zhuǎn)移DNA，屬低拷貝嚴緊型，質(zhì)粒較大，操作不便

3)F因子（性因子）質(zhì)粒載體DNA的分離——堿裂解法堿裂解法是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的的。在pH大于12的堿性條件下染色體DNA的氫鍵斷裂雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補鏈不會完全分離，當pH恢復至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復到原來的構(gòu)型保存在溶液中。而染色體DNA不能復性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒DNA。1.5.2

重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體1.5.2.1.

pSC101質(zhì)粒載體pSC101是一種嚴緊型復制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個寄主細胞僅有1～2個拷貝。其分子大小為9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（tetr）。

pSC101質(zhì)粒不僅具有可插入外源DNA的多個限制性核酸內(nèi)切酶的單克隆位點，而且還具有四環(huán)素抗性的強選擇記號，因此，它被選為第一個真核基因的克隆載體。當然，這個質(zhì)粒載體也有其明顯的缺點，它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細胞中提取pSC101DNA，其產(chǎn)量就要比其它質(zhì)粒載體低得多。1.5.2.2.

ColE1質(zhì)粒載體

ColE1質(zhì)粒屬于松弛型復制控制的多拷貝質(zhì)粒。在正常生長條件下，當培養(yǎng)基中用于蛋白質(zhì)合成的氨基酸被耗盡，或是在對數(shù)生長末期的細胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復制便被抑制，細胞的生長也隨之停止。此時，松弛型復制控制的質(zhì)粒DNA仍然可以繼續(xù)進行復制達數(shù)小時之久，使每個寄主細胞中所累積的ColE1質(zhì)?？截悢?shù)增加到1000~3000個之多，質(zhì)粒DNA大約可占細胞總DNA的50%左右。由此可見，由于質(zhì)粒拷貝數(shù)高，插入的外源DNA片段的產(chǎn)量也就得到相應的提高。

1.5.2.3

pBR322質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒是由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復制起點（ori）。123第一個優(yōu)點：分子量較小，易于純化，操作便利。第二個優(yōu)點：具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。質(zhì)粒DNA編碼的抗生素抗性基因的插入失活效應，是檢測重組體質(zhì)粒的一種十分有用的方法。第三個優(yōu)點：具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴增，每個細胞中可累積1000~3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點思考題使用pBR322載體進行基因克隆易于造成載體自身連接環(huán)化,為什么?1.5.2.4

pUC質(zhì)粒載體pUC系列質(zhì)粒載體包括如下四個部分：(i)來自pBR322