第三章-植物細胞工程123節(jié)

第三章植物細胞工程

PlantCellEngineering第一節(jié)細胞工程的基礎知識與基本技術1.基礎知識原核細胞：DNA裸露，生長迅速，易于操作；但細胞壁為肽聚糖，表達真核基因受一定限制。真核細胞：接近人類需要，但具細胞周期，要同步化培養(yǎng)；生長慢，植物細胞和真菌細胞具細胞壁（纖維素和果膠）。植物細胞的結構特征植物細胞的亞顯微結構

（質膜）洋蔥表皮細胞顯微結構細胞壁cellwall細胞核nucleus液泡vacuole細胞質Cytoplasm葉綠體Chloroplast動植物細胞區(qū)別

細胞壁、質體、液泡三部分是植物細胞特有的結構，動物細胞沒有。植物細胞是完整的,一個健全的植物細胞通過分化與增殖可發(fā)于成一株完整的植物,但動物細胞不可以。模式植物細胞構造

細胞壁胞間層初生壁次生壁后含物

原生質體貯藏物質晶體細胞膜細胞質細胞器細胞核模式植物細胞模式植物細胞是由細胞壁、原生質體、后含物三大部分組成質體線粒體液泡內質網核糖體高爾基體植物細胞全能性指植物的每個細胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。在適宜條件下，任何一個細胞都可以發(fā)育成一個新個體。植物細胞全能性是植物組織培養(yǎng)的理論基礎。離體培養(yǎng)之所以能夠成功，首先是由于植物細胞具有全能性的緣故。一個細胞所具有的產生完整生物個體的固有能力。2.基本操作2.1無菌操作概念與技術無菌室布局、衛(wèi)生、消毒、超凈臺第一節(jié)細胞工程的基礎知識與基本技術無菌操作asepsis實驗員消毒實驗室、無菌臺滅菌實驗器材的滅菌無菌接種消毒實驗臺衛(wèi)生培養(yǎng)室培養(yǎng)(1)消毒，更換實驗服、帽子與鞋子，進入接種室。(2)打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關閉。(3)開啟過濾室風機，使無菌風吹拂工作臺面和四周的臺壁。(4)用70%—75%的酒精擦拭工作臺和雙手。(5)用沾有70%—75%酒精的紗布擦拭盛培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進工作臺。(6)把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。(7)在酒精燈火焰附近切割備用的接種材料。(8)打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉動瓶口使瓶口各部分都燒到。(9)取下接種器械，在火焰上消毒。(10)把培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。(11)接種結束后，清理和關閉超凈工作臺。取樣滅菌培養(yǎng)傳代收獲除菌取樣原生質體融合篩選鑒定2.基本操作2.1細胞培養(yǎng)技術第一節(jié)細胞工程的基礎知識與基本技術2.3

細胞融合技術第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境一、所需環(huán)境條件與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的材料的生長要受到溫度、光照、濕度等各種物理條件，不同氣體、培養(yǎng)基的組成、pH值和滲透壓等各種化學條件，以及外植體部位、大小、細胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據需要來控制培養(yǎng)條件是組織培養(yǎng)中的一個重要問題。溫度光照濕度氣體培養(yǎng)基的滲透壓pH值植物材料一般最適溫度在25±2℃之間環(huán)境條件最常用的光周期是光照16h，黑暗8h一般情況下，培養(yǎng)器內相對濕度應達100%，培養(yǎng)室內環(huán)境的相對濕度在70%—80%氧氣是愈傷組織生長所必需的

調節(jié)滲透壓常常從糖入手

植物組織培養(yǎng)時培養(yǎng)基的pH值大多在5.0—6.5二、營養(yǎng)成分植物體內至少含有幾十種化學元素，其中大部分元素在植物體內起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機體的建造，成為結構物質；b、構成一些特殊的生理活性物質，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協調，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等點化學方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境國內外公認的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種：

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時期、不同條件下含量也不同。根據植物體內含量多少，可把這些元素分為※大量營養(yǎng)元素：占干物質重量的0.1%以上；

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種※微量營養(yǎng)元素：占干物質重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kgFe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國際植物生理協會的建議：所需濃度>0.5mmol/L的元素為大量元素所需濃度<0.5mmol/L的元素為微量元素1、大量元素N:是蛋白質、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。

P:是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K:對碳水化合物合成，轉移，以及氮素代謝等有密切關系。二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境Mg、S、Ca:是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結構具有穩(wěn)定作用；S:是含S氨基酸的蛋白質的組成成分。Ca:是構成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩(wěn)定質膜結構有顯著作用，此外，Ca及鈣調素在細胞信號轉導中起重要作用。2、微量元素

在微量元素中，鐵的使用最大：

◆一些氧化酶的組成成分

◆葉綠素形成的必要條件

◆使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境

硼與蛋白質合成、糖類運輸有著密切的關系

銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長

錳參與植物的光合、呼吸代謝

鉬參與氮素的代謝

氯是光合作用水光解的活化劑

微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調節(jié)。二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境3、碳源碳源物質包括糖類物質、醇類物質和有機酸，以糖類物質最重要。糖類物質特點：

◆具有熱易變的性質◆利于吸收和利用

◆使用濃度一般在2%—5%

◆提供能源和調節(jié)滲透壓二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境4、維生素類

◆以各種輔酶的形式存在◆參與多種代謝活動◆對生長，分化等有很好的促進作用◆主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素◆常用維生素有VB1和VB6

二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境5、肌醇◆環(huán)己六醇◆細胞壁的構建材料◆參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動◆促進活性物質發(fā)揮作用二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境6、氨基酸

◆蛋白質的組成成分

◆有機氮源

◆可直接被細胞吸收利用

◆培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境7、天然復合物

◆促進某些愈傷組織和器官的生長

◆化學成分不明、復雜

◆天然營養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境8、瓊脂

◆是使用最普遍的凝固劑◆用量一般在6—10g/L之間◆顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品

除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結冷膠等。二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境9、活性炭

◆吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質

◆抑制外植體褐變

◆防止玻璃苗的產生

◆促進培養(yǎng)物生長和分化

◆促進生根缺點：

◆沒有選擇性10、抗生素

◆防止外植體內生菌造成的污染活性炭二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境11、生長素類

◆促進細胞伸長和分裂

◆促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢、單性結實

◆誘導愈傷組織形成

◆溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好

◆常用的生長素：

IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸)二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境12、細胞分裂素類

◆促進細胞分裂和分化

◆誘導胚狀體和不定芽的形成

◆延緩組織的衰老并增強蛋白質的合成

◆用于離體成花的調控

◆溶于0.5—1.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中

◆常用的細胞分裂素：

KT(激動素)BA(6-卞基腺嘌呤)2-ip(異戊烯氨基嘌呤)玉米素二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境13、赤霉素類和脫落酸

A、赤霉素類

◆組織培養(yǎng)中不常使用

◆加速細胞的伸長生長

◆促進細胞的分裂

◆主要是GA3

B、脫落酸

◆抑制細胞分裂和伸長

◆促進脫落和衰老

◆促進休眠和提高抗逆能力二、營養(yǎng)成分第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境◆培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基◆培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基◆其作用不同：誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基

◆營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基的種類三、培養(yǎng)基的配制、滅菌與保存第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境MS培養(yǎng)基:

◆無機鹽濃度高◆高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽◆含有一定數量的銨鹽◆營養(yǎng)豐富◆不需要添加更多的有機附加物2、幾種常見培養(yǎng)基的特點第二節(jié)植物細胞工程培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境三、培養(yǎng)基的配制、滅菌與保存White培養(yǎng)基

◆1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計

◆1963年作了改良，提高MgSO4的濃度和增加硼元素

◆無機鹽濃度較低◆使用廣泛◆在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果大量元素含量微量元素含量鐵鹽含量有機物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)24H2O300MnSO44H2O7.0煙酸0.3瓊脂8000MgSO47H2O720ZnSO47H2O3.0鹽酸硫胺素0.1

NaH2PO44H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡哆辛0.1KCl65CuSO45H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：White培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基

◆1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計

◆含有較低的銨鹽

◆較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分數量(mg/l）組成成分數量(mg/l)KNO3

2500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO43.0煙酸1.0MnSO4·4H2O10鹽酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激動素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025鹽酸硫銨10Na2-EDTA37.3

B5培養(yǎng)基的組成和配方N6培養(yǎng)基

◆1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設計

◆

KNO3和（NH4）SO4含量高，不含鉬組成成分數量(mg/l)組成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463煙酸0.5KI0.8鹽酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4鹽酸硫銨1.0ZnSO4·7H2O1.5N6培養(yǎng)基組成及配方配制培養(yǎng)基應做好幾點工作：（1）實驗用具的準備。包括配制過程中所需電爐、酸度計、高壓滅菌鍋等設備及其他玻璃器皿的清洗和準備(2)試劑、藥品的準備(3)根據培養(yǎng)基的配方、母液擴大倍數及需要配制的培養(yǎng)基體積計算所需各種母液及其他附加物的量3、培養(yǎng)基的配制具體操作如下：1、取規(guī)定數量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷鍋內，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌；2、根據計算所需量依次加入大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、生長調節(jié)物質母液及其他特殊的附加物，攪拌均勻；3、加水定容至規(guī)定體積，攪拌均勻；4、調整培養(yǎng)基的pH值；5、分裝；6、封口。組織培養(yǎng)必須在無菌環(huán)境中進行，因此培養(yǎng)基的滅菌操作非常重要。培養(yǎng)基分裝封口后立刻進行滅菌，至少在24h內完成滅菌程序。一般采用的是高壓蒸汽滅菌。4、培養(yǎng)基的滅菌

滅菌鍋有很多種，實驗室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時要注意一下幾點：1、鍋中應放足量的水，以免造成空燒或干燒；2、裝鍋時不要過度傾斜，可保持內部有一定的空間，利于蒸汽流動；3、增壓前高壓鍋內的空氣必須排凈，否則易影響滅菌效果；4、滅菌過程中，應盡量保持壓力恒定，嚴格遵守滅菌時間；5、排氣降壓時應緩慢進行；6、只有待高壓鍋內壓力表指針恢復到零后，才能開啟壓力鍋；7、高壓鍋工作時，應有專人看守?！魷缇蟮呐囵B(yǎng)基經冷卻和凝固后即可使用檢驗滅菌效果。檢驗方法：將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室中3天，若沒有污染現象，說明滅菌可靠，可以使用?！舯４嬖诘蜏貤l件下。常溫下保存時要進行防塵和避光處理?！舯４鏁r間不可過長。5、培養(yǎng)基的保存一、概述1.植物組織培養(yǎng)概念（concept）狹義概念：

指對植物體組織或由植物器官培養(yǎng)產生的愈傷組織（callus）進行培養(yǎng)直至生成完整植株。廣義概念：無菌操作分離植物體一部分(即外植體)接種到培養(yǎng)基，在人工條件下培養(yǎng)直至生成完整植株。生物技術中的一個基本技術第三節(jié)植物組織培養(yǎng)愈傷組織〔callus〕:在離體培養(yǎng)過程中形成的具有分生能力的一團不規(guī)則細胞，多在植物體切面上產生。指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的組織。它由活的薄壁細胞組成，起源于植物體任何器官內各種組織的活細胞。這種組織沒有發(fā)生分化。在適合的光照、溫度和一定的營養(yǎng)物質與激素等條件下，愈傷組織才開始分化，產生出植物的各種器官和組織，進而發(fā)育成一棵完整的植株。外植體〔explant〕：從植物體上分離下來的用于離體培養(yǎng)的材料。胚軸花粉胚乳胚種子果實花器葉芽莖根組織原生質體子葉子房苞片胚珠花藥花梗分生組織成熟組織花托葉柄幼苗2.植物組織培養(yǎng)的理論基礎細胞全能性（totipotency）理論植物每一個具有完整細胞Totipotencyistheabilityofasinglecelltodivideandproduceallofthedifferentiatedcellsinanorganism的體細胞，都含有植物體的全部遺傳信息，在適當條件下，具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。1958年Steward等人在以胡蘿卜根組織為外植體的組織培養(yǎng)實驗中，證實了細胞的全能性。3.相關名詞分化〔differentiation〕細胞在分裂過程中發(fā)生結構和功能上的改變，從而在個體發(fā)育中形成各類組織和器官完成整個生活周期。脫分化〔dedifferentiation〕已分化好的細胞在人工誘導條件下，恢復分生能力，回復到分生組織狀態(tài)的過程。再分化〔redifferentiation〕脫分化后具有分生能力的細胞再經過與原來相同的分化過程，重新形成各類組織和器官的過程。植物組織培養(yǎng)過程總結離體的植物器官、組織或細胞（外植體）離體的植物器官、組織或細胞（外植體）愈傷組織根、芽植物體脫分化再分化4.植物組織培養(yǎng)的特點（CharacteristicsofPlantTissueCultureTechniques）(1)培養(yǎng)條件可以人為加以控制

(2)繁殖系數大，培養(yǎng)周期短(3)管理方便，有利于實現工廠化生產和自動化控制5.組織培養(yǎng)發(fā)展歷史

1902年Haberlandt首次進行離體細胞實驗，發(fā)表了“植物離體細胞培養(yǎng)實驗”報告；1934年White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性系，第一次器官培養(yǎng)；1939年White、Gautheret和Nobecourt愈傷組織培養(yǎng)實驗成功，第一次進行細胞/組織培養(yǎng)；1957年Skoog和Miller提出了有關植物激素控制器官形成的概念，通過改變培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素這兩類生長調節(jié)物質的相對濃度可以控制器官的分化；

1958年Steward在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細胞胚；1960年Morel提出了一個離體無性繁殖蘭花的方法；繁殖系數高，迅速建立起“蘭花工業(yè)”；1962年Murashige和Skoog為煙草組織培養(yǎng)建立了培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基被證明適合大部分植物的組織培養(yǎng)，至今仍被廣泛使用。自60年代以來，組織培養(yǎng)技術得到了飛速發(fā)展，特別是進30年來，迄今進行組培的植物已達3000多種，已從開始時的純學術性研究，發(fā)展到今天有巨大應用價值的技術。離體的植物器官、組織、細胞脫分化愈傷組織再分化芽根植物體培養(yǎng)植物組培的基本過程Schemeofplanttissueculture二、植物組織培養(yǎng)的基本要求

1、植物組織培養(yǎng)的基本流程二、植物組織培養(yǎng)的基本要求

1、植物組織培養(yǎng)的基本流程植物組培的基本過程除菌與接種

自來水多次漂洗消毒劑處理無菌水反復沖洗外植體

無菌濾紙吸干切割

無菌外植體小塊外植體置培養(yǎng)基上培養(yǎng)起始培養(yǎng)

消毒劑使用濃度/%清除消毒時間/min滅菌效果次氯酸鈉2容易5~30很好次氯酸鈣9~10容易5~30很好漂白粉飽和溶液容易5~30很好升汞0.1~1較難2~10最好

酒精70~75容易0.2~2好過氧化氫10~12最容易5~15好溴水1~2容易2~10很好硝酸銀1較難5~30好抗生素4~50mg/L中等30~60較好常用消毒劑的使用和效果

轉移到溫室大田移栽和生長組織培養(yǎng)實驗室布局