鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)演示文稿

鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有23頁\編輯于星期三優(yōu)選鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)Ppt現(xiàn)在是2頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)針對(duì)病原體本身的生長繁殖、生理生化特性的檢測(cè)：鼠疫菌的染色檢查；鼠疫菌的培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)；鼠疫菌的生化檢查、營養(yǎng)需求、毒素檢測(cè)、毒力測(cè)定等。針對(duì)病原體特異性抗原結(jié)構(gòu)的檢測(cè)：鼠疫F1抗原抗體檢測(cè)；鼠疫菌外膜蛋白的檢測(cè)。針對(duì)病原體遺傳基因的檢測(cè)：鼠疫菌的質(zhì)粒檢測(cè)；鼠疫菌特異性核酸片斷的檢測(cè)；鼠疫菌全基因組測(cè)定；插入序列的檢測(cè)?，F(xiàn)在是3頁\一共有23頁\編輯于星期三一、鼠疫菌菌體形態(tài)檢查典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長1~2μm，寬0.5~0.7μm,中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染的卵圓形小桿菌，有莢膜，無鞭毛，無芽胞。革蘭氏染色陰性。染疫動(dòng)物或患者及其尸體的新鮮臟器制備的壓印片，可見到兩端鈍圓、兩極濃染的典型鼠疫菌。壓印標(biāo)本中可在吞噬細(xì)胞內(nèi)外見到鼠疫菌，對(duì)于鑒別雜菌污染材料極有價(jià)值。鼠疫菌染色方法有革蘭氏染色（菌體染成紅色）、美蘭染色（菌體染成蘭色，兩極濃染明顯）、姬姆薩染色（菌體染成色，莢膜染成色）現(xiàn)在是4頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫菌染色檢查(臟器壓印片)美蘭染色革蘭氏染色現(xiàn)在是5頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫菌染色鼠疫菌涂片的革蘭氏染色現(xiàn)在是6頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫菌染色檢查Waysonstain(魏申氏染色)呈現(xiàn)的兩極濃染特征莢膜染色—墨汁負(fù)染色現(xiàn)在是7頁\一共有23頁\編輯于星期三二、鼠疫菌的培養(yǎng)特性鼠疫菌是典型的異養(yǎng)菌。鼠疫菌為需氧菌，亦為兼性厭氧菌。鼠疫菌在普通培基上生長良好，培養(yǎng)的最適溫度為28℃，最適pH為，發(fā)育初期的最適氧化還原電位（Eh）約為100~150mV，接種后至少20h以上才能形成肉眼可見的菌落，一般24~48h形成肉眼可見的小菌落。強(qiáng)毒鼠疫菌對(duì)鈣離子有半依賴性，缺乏時(shí)生長不良。37℃缺鈣條件下強(qiáng)毒鼠疫菌生長受限并釋放大量Yops,表現(xiàn)很強(qiáng)的表達(dá)和分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此現(xiàn)象稱為低鈣反應(yīng)，受70kb(45MD)質(zhì)粒上的遺傳基因控制。典型鼠疫菌培養(yǎng)18-20h光鏡下呈透明的碎玻璃片狀。培養(yǎng)24h以上菌落在透過光線下呈灰白色略帶淡青色，反射光線下菌落圓形隆起呈淡灰白色，鏡下見菌落中心發(fā)暗，有黃褐色粗糙顆粒，周邊圍繞一圈寬窄不等，邊緣不整呈鋸齒狀、薄而透明的花邊?，F(xiàn)在是8頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫噬菌體試驗(yàn)在培基上密集平行劃線培養(yǎng)鼠疫菌，鼠疫噬菌體滴于上端劃線中部，直立平板，使噬菌體液垂直劃線自然流下，置20℃培養(yǎng)24h,有明顯的噬菌帶。在18~22℃鼠疫噬菌體只能裂解鼠疫菌而不裂解假結(jié)核菌，具有較強(qiáng)的專一性(噬菌作用具有種的特異性)，是鼠疫細(xì)菌學(xué)診斷中特異的鑒定方法之一。鼠疫噬菌體試驗(yàn)可快速診斷鼠疫菌。對(duì)被檢材料作細(xì)菌分離培養(yǎng)的同時(shí)作噬菌體裂解試驗(yàn)，20h左右即可獲得結(jié)果。分離到鼠疫噬菌體，可以間接判定檢材中存在鼠疫菌?，F(xiàn)在是9頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)典型鼠疫菌菌落形態(tài)噬菌帶現(xiàn)在是10頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)鼠疫菌培養(yǎng)特征鼠疫噬菌體試驗(yàn)現(xiàn)在是11頁\一共有23頁\編輯于星期三三、鼠疫F1抗原、抗體檢測(cè)鼠疫F1抗原檢測(cè)1.反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)4.免疫熒光技術(shù)(IFT)鼠疫F1抗體檢測(cè)1.間接血球凝集試驗(yàn)(IHA)2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)現(xiàn)在是12頁\一共有23頁\編輯于星期三間接紅血球凝集試驗(yàn)(IHA)鼠疫菌特異性F1抗原致敏經(jīng)單寧酸鞣化處理的醛化綿羊紅血球，制備成F1抗原致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗體。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定均為常規(guī)操作。IHA微量法結(jié)果：現(xiàn)在是13頁\一共有23頁\編輯于星期三反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)用F1抗體致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗原。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定與IHA相同。RIHA微量法結(jié)果：現(xiàn)在是14頁\一共有23頁\編輯于星期三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)抗體.雙抗原夾心法：F1抗原包被反應(yīng)板，加入待測(cè)標(biāo)本28℃反應(yīng)1.5h洗板，加入HRP-F1抗原28℃反應(yīng)1h洗板，加入底物OPD蔽光反應(yīng)30min后加終止液(2mol/L硫酸)。間接法：已知F1抗原包被反應(yīng)板，加標(biāo)本37℃反應(yīng)1h洗板，加入酶標(biāo)二抗37℃反應(yīng)1h洗板，加入底物(如OPD或TMB)蔽光反應(yīng)30min顯色后加終止液。用肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度值(A)測(cè)抗原雙單抗夾心法：F1-McAb包被反應(yīng)板，加入標(biāo)本28℃反應(yīng)1.5h洗板，加入HRP-F1McAb28℃反應(yīng)1h洗板，加入底物OPD蔽光反應(yīng)30min后加終止液。雙抗體夾心法(改良法-美國CDC鼠疫診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè))：鼠疫免疫血清特異性抗體(F1Ab)包被反應(yīng)板，加標(biāo)本37℃反應(yīng)1h洗板，加小鼠F1McAb液37℃靜置1h洗板，加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG37℃反應(yīng)1h洗板,加底物OPD蔽光反應(yīng)30min顯色，加終止液。肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度值(A)現(xiàn)在是15頁\一共有23頁\編輯于星期三膠體金免疫層析法(GICA)檢測(cè)鼠疫菌特異性抗原、抗體的金標(biāo)技術(shù)以GICA廣泛用于實(shí)踐?；驹砭鶠閵A心法。雙抗體夾心法測(cè)抗原：固定于NC膜上的單抗(F1McAb)+標(biāo)本中待測(cè)抗原(F1Ag)+金標(biāo)記的另一株單抗(金標(biāo)-F1McAb)顯色。雙抗原夾心法測(cè)抗體：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(F1Ag)+標(biāo)本中待測(cè)抗體(F1Ab)+金標(biāo)記的F1抗原(金標(biāo)-F1Ag)顯色。夾心法測(cè)抗體：固定于膜上的鼠疫F1抗原＋標(biāo)本中的相應(yīng)抗體＋金標(biāo)記的SPA顯色?，F(xiàn)在是16頁\一共有23頁\編輯于星期三GICA雙抗體夾心法—測(cè)抗原G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(鼠型F1McAb)C區(qū)：羊抗小鼠IgT區(qū)：特異性單克隆抗體(F1McAb)

吸水紙標(biāo)本現(xiàn)在是17頁\一共有23頁\編輯于星期三免疫熒光技術(shù)(IFT)標(biāo)記物-熒光素(如異硫氰熒光素FITC)熒光素標(biāo)記抗體檢測(cè)相應(yīng)抗原-直接法：如FITC-FIMcAb為異硫氰酸熒光黃標(biāo)記鼠疫F1單克隆抗體。方法：固定好的玻片標(biāo)本用1%牛血清PBS浸洗5分鐘，流水沖洗。用FITC-FIMcAb適量（0.2ml）熒光染色，室溫作用30分鐘，流水沖洗。干燥，熒光顯微鏡油鏡觀察，鼠疫菌染上翠綠色熒光Yersiniapestis

免疫熒光染色Fluorescenceantibodypositivityisseenasbright,intensegreenstainingaroundthebacterialcell現(xiàn)在是18頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫菌特異性基因片斷檢測(cè)—PCR目標(biāo)基因：鼠疫菌的fra和pla特異性基因片段引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的長度目標(biāo)基因引物序列產(chǎn)物長度

fra1F5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’249bp1R5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’

pla2F5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’456bp2R5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’內(nèi)部對(duì)照：以鼠疫菌EV株DNA為模板，采用上述f1引物擴(kuò)增出fra基因249bp片段，再以16SrRNA基因引物：

F5’-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3’R5’-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3’

擴(kuò)增出16SrRNA基因396bp片段加載體重組而成，產(chǎn)物長度645bp

，使用了內(nèi)部對(duì)照，可有效的防止假陰性結(jié)果。應(yīng)用多重PCR方法來檢測(cè)鼠疫菌，所選取的擴(kuò)增區(qū)域都為鼠疫菌的特異區(qū)域，可有效地將鼠疫菌與其它細(xì)菌相鑒別，具有較高特異性?，F(xiàn)在是19頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系(總量25μl)采用其它總量時(shí)，下列配方按比例改變。無菌去離子水13.5μl10×反應(yīng)緩沖液2.5μl4×dNTP混合物（每種2.5mM）2μl引物（1F、1R、2F、2R）各1μl內(nèi)部對(duì)照模板(IC)1μl待測(cè)標(biāo)本1μlTaqDNA聚合酶1μl現(xiàn)在是20頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫PCR反應(yīng)條件(擴(kuò)增)

：預(yù)變性95℃5min，1個(gè)循環(huán)；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃5min。共1小時(shí)40分。電泳：反應(yīng)管中加溴酚藍(lán)指示劑5μl，混均短暫離心。膠體的每一孔中加入上述處理的反應(yīng)產(chǎn)物8μl，在80--100V(不超過5V/cm)電壓下TBE緩沖液中電泳約1小時(shí)。凝膠成像儀讀取結(jié)果并照相?，F(xiàn)在是21頁\一共有23頁\編輯于星期三多重PCR擴(kuò)增結(jié)果鼠疫PCR

內(nèi)部對(duì)照質(zhì)粒與不同濃度EV菌

PCR擴(kuò)增結(jié)果

鼠疫多重PCR

多重PCR擴(kuò)增結(jié)果現(xiàn)在是22頁\一共有23頁\編輯于星期三鼠疫菌質(zhì)粒檢測(cè)鼠疫菌的三個(gè)尋常質(zhì)粒：pPCP1—6Mda(9.5kb)編碼