生物醫(yī)學(xué)工程前沿之疾病治療基因療法

生物醫(yī)學(xué)工程前沿之疾病治療基因療法第1頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

第一章緒論第二章生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)與疾病診斷

第三章疾病治療

§1藥物治療§2細(xì)胞療法§3基因療法

§4介入療法第四章組織工程與人工器官

§1生物材料§2種子細(xì)胞§3生物反應(yīng)器§43D打印技術(shù)第2頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一：概論二：基本原理——“基因工程”三：人類遺傳疾病的基因療法四：現(xiàn)狀及存在問題§3基因療法第3頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一：基因療法概論經(jīng)典（狹義）：針對(duì)遺傳病某一基因缺陷，將外源基因?qū)塍w內(nèi)予以矯正?，F(xiàn)在（廣義）：凡是在基因水平上進(jìn)行操作而達(dá)到治療疾病目的的所有療法。（一）概念第4頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（二）分類5根據(jù)靶細(xì)胞的類型分類：

1、生殖細(xì)胞（germcell)基因治療

2、體細(xì)胞（somaticcell)基因治療根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑分類：

1、Invivo(活體直接轉(zhuǎn)移或稱一步法）

2、Exvivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法）第5頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一根據(jù)治療策略分類：1、基因置換：用正常的基因原位置換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因（等位基因）。2、基因修復(fù)：將致病基因的突變堿基序列定點(diǎn)糾正，可用來(lái)治療點(diǎn)突變導(dǎo)致的疾病。3、基因增補(bǔ)：將目的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，補(bǔ)償缺陷細(xì)胞的功能，可用于隱性遺傳病的治療。4、基因失活：利用反義技術(shù)特異性封閉、抑制有害基因表達(dá)，可用于一些顯性遺傳病或腫瘤的基因治療。第6頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）發(fā)展歷史時(shí)間發(fā)生事件研究者1944DNA是轉(zhuǎn)化物質(zhì)Avery1953DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型WatsonandCrick1963遺傳密碼的破譯Brenner1979重組體DNA技術(shù)、基因轉(zhuǎn)染MulliganandBerg1980臨床地貧研究Cline1990第一個(gè)臨床試驗(yàn)（ADA)基因BlaséandAnderson1992大量癌癥臨床試驗(yàn)美國(guó)等1993中國(guó)制定第一部基因治療質(zhì)控要點(diǎn)中國(guó)1997-重組病毒的產(chǎn)業(yè)化及其技術(shù)改進(jìn)美國(guó)第7頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）發(fā)展歷史世界第一個(gè)基因治療臨床試驗(yàn)：

上世紀(jì)九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脫氨酶)基因缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重免疫缺損的四歲女孩，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院用ADA基因治療，取得療效?！盎蛑委煛毖芯繜釓拇瞬叭澜?，起而效顰，為保障人類健康展現(xiàn)了美好的前景。第8頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一世界第一個(gè)基因治療藥物

2003年10月16日，深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司研制開發(fā)的抗癌新藥——“重組人p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”）獲得國(guó)家儀器藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書。這標(biāo)志著我國(guó)在基因治療藥物研制和產(chǎn)業(yè)化方面已達(dá)世界領(lǐng)先水平，在國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中搶占了先機(jī)。賽百諾公司負(fù)責(zé)人說(shuō)，這種新藥是擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的廣譜腫瘤基因治療藥品，可望2004年1月正式上市。第9頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第10頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一亞洲第11頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一中國(guó)第12頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第13頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第14頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二：基因療法的基本原理——基因工程

基因工程，也叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)，是指在生物體外，通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性繁殖（克?。怪亟M基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出所需要的基因產(chǎn)物。第15頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一操作環(huán)境生物體外？操作對(duì)象基因操作水平DNA分子水平基本過(guò)程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物第16頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一你身邊的基因工程第17頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一食用油轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因植物第18頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一雜交=基因工程？第19頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Twobreakthroughs—Imitationeggsmadeofsoybeansandimitationsoybeansmadeofeggs第20頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Congratulations--YouarethefirstvictimofrecombinantDNA第21頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Ihopethere'snothinggeneticallymodifiedinthis第22頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一興奮迷信恐懼理性第23頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（1）DNA是遺傳物質(zhì)：

不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。地球上的一切生物，從細(xì)菌直至人類，它們的基因都是一個(gè)具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本結(jié)構(gòu)都是一樣的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原則上是可以重組互換的。（一）基因工程理論基礎(chǔ)第24頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)：

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)制。第25頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（3）中心法則，遺傳密碼

遺傳密碼是通用的。一系列三聯(lián)密碼子（除極少數(shù)的幾個(gè)以外）同氨基酸之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，在所有生物中都是相同的。重組的DNA分子不管導(dǎo)入什么樣的生物細(xì)胞中，只要具備轉(zhuǎn)錄翻譯的條件，均能轉(zhuǎn)譯出原樣的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因）同樣可以轉(zhuǎn)錄翻譯出相應(yīng)的氨基酸?，F(xiàn)在，基因是可以人工合成的。第26頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（4）基因可切割基因直線排列在DNA分子上。除少數(shù)基因重疊排列外，大多數(shù)基因彼此之間存在著間隔序列。因此，作為DNA分子上一個(gè)特定核苷酸序列的基因，允許從DNA分子上一個(gè)一個(gè)完整地切割下來(lái)。即使是重疊排列的基因，也可以把指定的基因切割下來(lái)，盡管破壞了其他基因。第27頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（5）基因可轉(zhuǎn)移基因不僅是可以切割下來(lái)的，而且發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)有的基因可以在染色體DNA上移動(dòng)，甚至可以在不同染色體間進(jìn)行跳躍，插入到靶DNA分子之中。由此表明基因不僅是可轉(zhuǎn)移的。（6）基因通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞經(jīng)重組的基因一般來(lái)說(shuō)是能傳代的，可以獲得相對(duì)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因生物。第28頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一①?gòu)募?xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌，克隆大量基因②限制酶截取DNA片斷（二）基因工程過(guò)程示意圖第29頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1、提取目的基因的方法——鳥槍法將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段;用限制酶切成許多片斷再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個(gè)細(xì)胞獲得了需要的目的基因并得以表達(dá)，基因工程就算成功了。該法最大的缺點(diǎn)是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。第30頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1、提取目的基因的方法--基因合成法逆轉(zhuǎn)錄法：以信使RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成DNA(基因)。DNA合成儀PCR擴(kuò)增儀直接合成法：根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。第31頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一WhatisPCR?:polymerasechainreaction

The“Reaction”Components1)TargetDNA-containsthesequencetobeamplified.2)PairofPrimers-oligonucleotidesthatdefinethesequencetobeamplified.3)dNTPs-deoxynucleotidetriphosphates:DNAbuildingblocks.4)ThermostableDNAPolymerase-enzymethatcatalyzesthereaction5)Mg++ions-cofactoroftheenzyme6)Buffersolution–maintainspHandionicstrengthofthereactionsolutionsuitablefortheactivityoftheenzyme第32頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一TheReactionTHERMOCYCLERPCRtube第33頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Denature(heatto95oC)Lowertemperatureto56oCAnnealwithprimersIncreasetemperatureto72oCDNApolymerase+dNTPs第34頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第35頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第36頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合用與提取目的基因相同的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)后，在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子。提取質(zhì)粒并用限制酶切割用連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接第37頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并擴(kuò)增基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。導(dǎo)入受體細(xì)胞常用的方法是借鑒細(xì)菌或者病毒侵染細(xì)胞的途徑。通常還要對(duì)一些受體細(xì)胞進(jìn)行增大通透性的處理。目的基因可以隨著受體細(xì)胞進(jìn)行快速的繁殖，在很短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的基因。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增第38頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）基因工程操作的主要工具將目的基因與運(yùn)載體DNA連接從人體細(xì)胞內(nèi)提取目的基因片斷DNA連接酶限制性內(nèi)切酶基因的“針線”基因的“剪刀”將目的基因運(yùn)入大腸桿菌等運(yùn)載體基因的“運(yùn)輸工具”第39頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1、基因的“剪刀”--限制性內(nèi)切酶分布：主要在微生物中。特點(diǎn)：特異性，即識(shí)別特定核苷酸序列，切割特定切點(diǎn)。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端（堿基互補(bǔ)配對(duì)）。一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點(diǎn)上將DNA分子切斷。目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有200多種。第40頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一限制性內(nèi)切酶作用過(guò)程點(diǎn)擊播放第41頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（1）兩個(gè)雙鏈DNA片段連接起來(lái)

5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA連接酶

5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ2、基因的“針線”--

DNA連接酶DNA連接酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈DNA中一條鏈的3ˊ－OH與另一條鏈的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構(gòu)成一條完整的DNA長(zhǎng)鏈。（2）修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈DNA分子T4DNA連接酶第42頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一DNA連接酶的作用過(guò)程點(diǎn)擊播放第43頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一其它一些重要的工具酶工具酶

活性DNA聚合酶

以DNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶

以RNA為模板合成DNA堿性磷酸酶

切除末端磷酸，防止載體自身環(huán)化連接T4多聚核苷酸激酶

催化核酸5'-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

催化3'-端合成同聚體尾第44頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一(1)作用：將外源基因送入受體細(xì)胞。(2)條件：能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保存；具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)；具有某些標(biāo)記基因。(3)種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。3、基因的“運(yùn)輸工具”–運(yùn)載體第45頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一質(zhì)粒細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體；最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒；存在于許多細(xì)菌及酵母菌等生物中；質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)影響；質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成。第46頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一供體4、基因工程的應(yīng)用第47頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1、基因工程藥物

（1）概念

從廣義上講凡在生產(chǎn)過(guò)程中涉及到基因工程的藥物都可以稱為基因工程藥物。（四）基因工程在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的應(yīng)用第48頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

先確定對(duì)某種疾病具有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)；

將控制該蛋白質(zhì)合成過(guò)程的基因進(jìn)行分離、純化或

人工合成；

利用重組DNA技術(shù)加以改造；

最后將該基因?qū)肟梢源罅可a(chǎn)的受體細(xì)胞中不斷

繁殖或表達(dá)；

進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療疾病的蛋白質(zhì)。

第49頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第50頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第51頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子人胰島素人生長(zhǎng)激素細(xì)胞因子類藥物人干擾素人白細(xì)胞介素集落刺激因子促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素酶類、凝血因子類藥物、疫苗等（2）：基因工程工藥物的種類第52頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第一代基因工程藥物是針對(duì)因缺乏天然內(nèi)源性蛋白所引起的疾病。應(yīng)用基因工程技術(shù)去擴(kuò)大這類多肽蛋白質(zhì)的產(chǎn)量以替代或補(bǔ)充體內(nèi)對(duì)這類活性多肽蛋白質(zhì)的需要，主要是以蛋白質(zhì)激素類為代表，如人胰島素、胰高血糖素、人生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素等。

第二代基因工程藥物是根據(jù)內(nèi)源性多肽蛋白的生理活性，應(yīng)用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)這些極為稀有物質(zhì)，以超正常濃度劑量供給人體，以激發(fā)它們的天然活性作為其治療疾病的藥理基礎(chǔ)，主要是以細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子為代表的，如G-CSF，GM-CSF，α-IFN等。第三代基因工程藥物是直接把目標(biāo)基因作為藥物，例如“重組人p53腺病毒注射液”。

第53頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（3）用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的部分人類蛋白質(zhì)及其功能第54頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一利用微生物發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)基因工程藥物是目前工業(yè)化生產(chǎn)基因工程藥物的最主要方法。

從1982年重組胰島素批準(zhǔn)上市以來(lái)，現(xiàn)已有近40種基

因工程蛋白質(zhì)藥物投放市場(chǎng)，主要用于治療癌癥、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、細(xì)菌感染、骨損傷、創(chuàng)傷、代謝病、外周神經(jīng)病、矮小癥、心血管病、糖尿病、不孕癥等疑難病。

利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程疫苗和利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)基因工程人類蛋白質(zhì)藥物的研究也取得重大進(jìn)展。

（4）：基因工程制藥的技術(shù)路徑第55頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

1989年，中國(guó)批準(zhǔn)了第一個(gè)在中國(guó)生產(chǎn)的基因工程藥物——重組人干擾素α1b，標(biāo)志著中國(guó)生產(chǎn)的基因工程藥物實(shí)現(xiàn)了零的突破。

截止1998年底，中國(guó)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物和疫苗產(chǎn)品共計(jì)15種，中國(guó)基因工程制藥產(chǎn)業(yè)銷售額已達(dá)到了7.2億元人民幣。

預(yù)測(cè)到2020年左右，我國(guó)生物技術(shù)研究產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值達(dá)25000億至30000億元。（5）：中國(guó)基因工程制藥的現(xiàn)狀第56頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

1990年以來(lái)利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程疫苗的研究得到了迅速的發(fā)展。

利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程疫苗，是將抗原基因?qū)胫参?，讓其在植物中表達(dá)，人或動(dòng)物攝入該植物或其中的抗原蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生對(duì)某抗原的免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗的研究主要集中在煙草、馬嶺薯、蕃茄、香蕉等植物。

轉(zhuǎn)基因植物基因工程疫苗第57頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

與傳統(tǒng)疫苗相比，轉(zhuǎn)基因植物疫苗具有突出的優(yōu)點(diǎn)：①生產(chǎn)成本低，可直接供人服用或飼喂動(dòng)物，不需要分離提純。②易于保存。轉(zhuǎn)基因植物疫苗常溫下就可以保存，無(wú)須冷藏保存，生產(chǎn)過(guò)程也無(wú)須嚴(yán)格無(wú)菌條件。③具有更好的免疫原性。植物細(xì)胞的全能性及其完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)使抗原蛋白保持了自然狀態(tài)下的免疫原性，而目前醫(yī)藥生產(chǎn)常用的微生物發(fā)酵系統(tǒng)不能對(duì)真核蛋白質(zhì)疫苗進(jìn)行正確的翻譯后加工，往往導(dǎo)致其免疫原性變?nèi)?。?8頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一④比傳統(tǒng)的免疫途徑更安全。轉(zhuǎn)基因植物疫苗不需要注射器和針頭之類的設(shè)備，避免由于消毒不嚴(yán)格而通過(guò)注射器和針頭傳播疾病的可能。⑤比傳統(tǒng)的免疫途徑更有效。植物細(xì)胞壁的存在可以抵抗胃酸、胰蛋白酶以及其他消化酶對(duì)抗原蛋白的直接消化，使其在小腸中逐漸釋放，利于激起較強(qiáng)的黏膜免疫反應(yīng)，達(dá)到免疫的目的。⑥應(yīng)用范圍廣，易于推廣。轉(zhuǎn)基因植物疫苗不僅可以直接應(yīng)用于人，而且可以通過(guò)添加到飼料中飼喂家畜和野生動(dòng)物，以達(dá)到免疫的目的。第59頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)基因工程人類蛋白質(zhì)藥物，其生產(chǎn)成本較微生物發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)法有顯著的降低。

其基本方法是：將藥用蛋白質(zhì)基因連接到乳汁蛋白質(zhì)基因的調(diào)節(jié)元件下游，然后將連接產(chǎn)物顯微注射到哺乳動(dòng)物受精卵或胚胎干細(xì)胞，當(dāng)轉(zhuǎn)基因胚胎長(zhǎng)成個(gè)體后，在泌乳期藥用蛋白質(zhì)基因表達(dá)，從動(dòng)物乳汁可獲得基因工程藥物。

乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程藥物的研究已取得了一些成功經(jīng)驗(yàn)，但離商業(yè)化生產(chǎn)還有距離。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程藥物第60頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三：人類遺傳疾病的基因療法狹義：針對(duì)遺傳病某一基因缺陷，將外源基

因?qū)塍w內(nèi)予以矯正。廣義：應(yīng)該包括基因的增補(bǔ)、基因的矯正、

基因的沉默。1、基因治療的概念（一）概論第61頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第62頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第63頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2、基因治療的步驟特異正?；虻姆蛛x與克隆

人類基因組計(jì)劃的主要任務(wù)之一就是要從大片段基因組區(qū)域或整條染色體DNA上鑒定出基因表達(dá)序列(geneexpressedsequences)或轉(zhuǎn)錄單位(transcriptionunits)。測(cè)定基因表達(dá)序列可直接鑒別人類目前認(rèn)定的6～10萬(wàn)(或僅3～5萬(wàn))個(gè)基因在染色體上的位置和排列順序，這就是人類基因組計(jì)劃所要構(gòu)建的第四張圖譜——基因表達(dá)圖譜，又稱基因轉(zhuǎn)錄圖譜。

第64頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一外源基因的轉(zhuǎn)移a）化學(xué)法：

將正?；駾NA（及其拷貝）與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，直接傾入培養(yǎng)基中與細(xì)胞接觸，由于鈣離子有促進(jìn)DNA透過(guò)細(xì)胞有作用，某些化合物可擾亂細(xì)胞膜，故可將DNA輸入細(xì)胞內(nèi)，并整合于受體細(xì)胞的基因組中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，整合基因得以表達(dá)，細(xì)胞亦可傳代。

這種方法簡(jiǎn)單，但效率極低，一般1000－100000個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞可結(jié)合導(dǎo)入的外源基因。要達(dá)到治療目的，就需要從病人獲得大量所需的受體細(xì)胞。當(dāng)然，可以通過(guò)選擇培養(yǎng)的方法來(lái)提高轉(zhuǎn)化率。第65頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一b）物理法：

①電穿孔法：將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過(guò)電擊使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔，周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，但有時(shí)也會(huì)使細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。

②顯微注射法：在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個(gè)細(xì)胞，工作耗力費(fèi)時(shí)。此法用于生殖細(xì)胞時(shí)，有效率可達(dá)10%。直接用于體細(xì)胞卻很困難。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用這種方法將目的基因注入生殖細(xì)胞，使之表達(dá)而傳代，這樣的動(dòng)物就稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，目前成功使用得較多的是轉(zhuǎn)基因小鼠它可作為繁殖大量后代的疾病動(dòng)物模型。

③脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體（liposome）法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達(dá)。第66頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一c）同源重組法：

將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過(guò)單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。

如在新基因片段旁組裝一Neo基因，則在同源重組后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin）的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而使未插入新基因片段的細(xì)胞死亡。

對(duì)于體細(xì)胞基因治療，體外培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，篩選量大，故在臨床上應(yīng)用也受限制難以進(jìn)行。今后如能改進(jìn)技術(shù)，提高重組率，這種定點(diǎn)修正基因的方法仍是有前景的。第67頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一d）病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法：

以病毒為載體（vector），將外源目的基因通過(guò)基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱為病毒運(yùn)載體（viralvector）。目前應(yīng)用的有兩種病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法，即反轉(zhuǎn)錄病毒載體和DNA病毒介導(dǎo)載體。

第68頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一①反轉(zhuǎn)錄病毒載體

反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使

RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。

在反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，最常用于人類的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（Mo-MLV）。第69頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一反轉(zhuǎn)錄病毒載體有以下的優(yōu)點(diǎn)：

首先是具有穿透細(xì)胞的能力，可使近100%的受體細(xì)胞被感染，轉(zhuǎn)化細(xì)胞效率高；

能感染廣譜動(dòng)物物種和細(xì)胞類型而無(wú)嚴(yán)格的組織特異性；

隨機(jī)整合的病毒可長(zhǎng)期存留，一般無(wú)害于細(xì)胞。

但也存在缺點(diǎn)：

這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細(xì)胞的染色體，而不適合于那些不能正常分裂的細(xì)胞，如神經(jīng)元。

最嚴(yán)重的問題是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細(xì)胞感染病毒和致癌的危險(xiǎn)性。因此，人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去，僅留它們的外殼蛋白，以保留其穿透細(xì)胞的功能，試圖避免上述缺點(diǎn)。這種改造后的病毒稱為缺陷型病毒。

第70頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一②DNA病毒介導(dǎo)載體

DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一般認(rèn)為這類病毒難于改造成缺陷型病毒。

1993年美法等國(guó)成功采用腺病毒載體進(jìn)行心、腦、肺、肝內(nèi)膽管和肌肉組織的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。

美國(guó)設(shè)計(jì)了一個(gè)新的腺病癥載體，它是用一個(gè)化學(xué)連接器即賴氨酸鏈將DNA栓在病毒外殼上，這樣組成的運(yùn)輸器，通過(guò)一個(gè)表面抗體而進(jìn)入細(xì)胞核，使宿主基因與治療基因共同表達(dá)。這個(gè)新病毒載體稱為腺病毒多賴氨酸DNA復(fù)合體。第71頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一采用復(fù)制缺陷的腺病毒進(jìn)行基因治療有以下優(yōu)點(diǎn)：

該病毒可感染分裂和非分裂的細(xì)胞，并能得到大量基因產(chǎn)物，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等基因缺陷的糾正有特殊意義；

病毒顆粒相對(duì)穩(wěn)定，并易于純化和濃縮，且感染力不降低；

可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種靶細(xì)胞而少游離于細(xì)胞基因組外，并持續(xù)表達(dá)；

已用于基因治療的Ad5屬腺病毒C亞群，無(wú)致癌性。

前述的新腺病毒載體還有一大優(yōu)點(diǎn)是可以成功地運(yùn)載48000bp的基因，而其它病毒只能運(yùn)輸7000bp的基因。第72頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第73頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3、選擇靶細(xì)胞的原則（體細(xì)胞）

①必須較堅(jiān)固，足以耐受處理，并易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)；

②具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長(zhǎng)，能存活幾月至幾年，最后可延續(xù)至病人的整個(gè)生命期；

③易于受外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化；

④在選用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，目的基因表達(dá)最好具有組織特異性的細(xì)胞。

第74頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

目前使用得較多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。皮膚成纖維細(xì)胞易于移植和從體內(nèi)分離，又可在培養(yǎng)中生長(zhǎng)，并易存活，故有人用之于乙型血友病的基因治療。

有不少遺傳病表現(xiàn)了肝細(xì)胞功能缺陷，因此，在家族性高膽固醇血癥的治療中，有將低密度脂蛋白（LDL）受體基因轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞的嘗試。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證明：β－半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（minidystrophin）基因都已證明能在肌細(xì)胞中表達(dá)。第75頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4、舉例說(shuō)明第76頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第77頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一進(jìn)行基因治療必須具備下列條件：選擇適當(dāng)?shù)募膊?，并?duì)其發(fā)病機(jī)理及相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)功能了解清楚；糾正該病的基因已被克隆，并了解該基因表達(dá)與調(diào)控的機(jī)制與條件；該基因具有適宜的受體細(xì)胞并能在體外有效表達(dá)；具有安全有效的轉(zhuǎn)移載體和方法，以及可供利用的動(dòng)物模型。5、基因治療臨床應(yīng)用的前提第78頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三：遺傳疾病的基因療法（二）癌癥的基因治療1、癌癥的發(fā)生

致癌病毒的感染是人類癌癥的病因之一；細(xì)胞原癌基因的惡性激活是另外一個(gè)主要原因（基因點(diǎn)突變、染色體異位等）第79頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第80頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一正常細(xì)胞DNA損傷DNA修復(fù)體細(xì)胞基因突變?cè)┗蚧罨职┗蚴Щ畹蛲龌蚴д{(diào)細(xì)胞增生>細(xì)胞死亡腫瘤細(xì)胞DNA損傷DNA修復(fù)失敗第81頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一C-rasH基因P21ras產(chǎn)物突變后GGC甘氨酸GTC纈氨酸點(diǎn)突變膀胱癌的癌基因突變第82頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一鐮刀形紅細(xì)胞貧血

（sicklecellanemia）第83頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第84頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2、癌癥的診斷內(nèi)窺鏡診斷：使用胃鏡檢查胃中的方法是最具代表性的一種，其優(yōu)點(diǎn)是一面觀察、一面拍照臨床上應(yīng)用比較廣泛。超聲波診斷：超聲波穿可透軟的組織，當(dāng)這種聲波碰到柔軟的組織中的硬塊，便會(huì)反射回來(lái)。乳房檢查時(shí)，對(duì)乳腺的柔軟塊發(fā)出超聲波，會(huì)透過(guò)柔軟的塊狀物從身體的另一側(cè)出去，碰到癌腫等硬細(xì)胞群時(shí)，便會(huì)反射回來(lái)。第85頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞學(xué)診斷：一般是配合內(nèi)窺鏡檢查一并進(jìn)行，對(duì)疑似腫瘤部位取出部分細(xì)胞作為診斷用。最常見的也是很簡(jiǎn)單的是對(duì)子宮癌的細(xì)胞診斷，這種癌肉眼看得到，使用儀器從有問題的部位采取細(xì)胞，對(duì)子宮癌的早期發(fā)現(xiàn)率已提高很多。第86頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一血液生化診斷：一般只有男性前列腺癌、以及肝癌檢查才使用，前者檢測(cè)血液中的酸性磷酸酵素異常增加，就可診斷為癌；后者檢測(cè)血液中的甲胎蛋白。這是一種精密度可信度教高的方法。第87頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因診斷：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),從DNA/RNA水平檢測(cè)分析致病基因的存在,變異和表達(dá)狀態(tài)從而對(duì)疾病作出診斷的技術(shù)。第88頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一樣品抽提PCR擴(kuò)增分子雜交雜交信號(hào)檢測(cè)DNARNA基因診斷的基本流程cDNA第89頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一Southern印跡（Southernblot)雜交第90頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一早期、超早期診斷：是腫瘤治愈的關(guān)鍵（1）蛋白質(zhì)指紋通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)不同片斷的變異情況檢測(cè)，對(duì)腫瘤及其它疾病的檢測(cè)準(zhǔn)確率可以達(dá)到90％以上，并將疾病發(fā)現(xiàn)的時(shí)間提前3年至5年，對(duì)人體不同類型腫瘤或其他疾病進(jìn)行預(yù)警。第91頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一早在人體某部位發(fā)生癌變前的數(shù)年前，人體內(nèi)的多種蛋白質(zhì)構(gòu)成就已經(jīng)發(fā)生改變。但在目前的國(guó)內(nèi)臨床腫瘤檢測(cè)中，大都只采取某一種蛋白質(zhì)標(biāo)記物，所以導(dǎo)致檢測(cè)的陽(yáng)性率較低。而蛋白質(zhì)指紋圖譜可以針對(duì)人體多種蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，繪制出專屬蛋白質(zhì)的“指紋”圖譜，大大提高了癌癥診斷的陽(yáng)性率。比如10個(gè)有可能發(fā)生卵巢癌的人中，一般只有3個(gè)會(huì)被目前臨床采用的方法檢測(cè)出來(lái)，陽(yáng)性率為30％；而通過(guò)蛋白質(zhì)指紋圖譜，這個(gè)準(zhǔn)確率可達(dá)98％。第92頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）基因芯片美國(guó)人類基因組研究所（NHGRI），使用DNA微陣列的方法同時(shí)觀察了6567個(gè)基因。在這些基因芯片上，每個(gè)基因的活性通過(guò)染色深淺來(lái)顯示。為了確定基因的表達(dá)形式，研究者們?nèi)缓笸ㄟ^(guò)一種稱為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的程序運(yùn)行了這些顏色深淺數(shù)據(jù)。這個(gè)程序模擬了大腦中神經(jīng)元的行為，可以通過(guò)試驗(yàn)和錯(cuò)誤進(jìn)行自我學(xué)習(xí)。Meltzer說(shuō)：“這樣就可以獲得癌癥中發(fā)生的完整信息了?！钡?3頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一研究者在2001年6月的NatureMedicine上報(bào)告說(shuō)，這個(gè)程序在學(xué)習(xí)了每種癌癥的特點(diǎn)之后，正確地鑒定了所有20個(gè)試驗(yàn)樣品。還象排除健康細(xì)胞一樣，正確地排除了五個(gè)其它類型癌癥的樣品。第94頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第95頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3、癌癥的基因治療抑癌基因的導(dǎo)入和癌基因的反義核酸導(dǎo)入療法。在超過(guò)50%的腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變。將野生型p53基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，在動(dòng)物體內(nèi)致瘤能力下降。Clayman等采用腺病毒攜帶p53基因治療頭頸部腫瘤取得了較好的療效。第96頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一在癌基因的反義基因治療中，目前已經(jīng)選取的靶基因很廣泛，癌基因包括c-src、c-fos、H-ras、K-ras、c-myc等；自分泌的生長(zhǎng)因子及其受體基因包括IGF-1、IGF-1受體、EGF、TGF-α等。Amini等首先將表達(dá)src反義基因的質(zhì)粒導(dǎo)入v-src過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，結(jié)果該細(xì)胞的致瘤性下降。Laird將帶有TGF-α反義基因的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株，細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤性下降；Lian將IGF-1反義基因?qū)隒6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，該細(xì)胞致瘤性下降。第97頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能源于腫瘤細(xì)胞本身的免疫原性不強(qiáng)（如MHC表達(dá)量不足），也可能源于抗原遞呈細(xì)胞不能提供足夠的共刺激信號(hào)（如B7）或者機(jī)體免疫因子分泌不足等。因此可以通過(guò)以下方法糾正機(jī)體腫瘤的免疫耐受狀態(tài)。免疫基因療法：第98頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（1）MHC抗原MHC抗原與免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答有關(guān)，只有T細(xì)胞識(shí)別了抗原呈遞細(xì)胞上的MHC抗原后，才能識(shí)別外來(lái)抗原并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。由于腫瘤細(xì)胞存在功能性MHCI類抗原和/或共刺激信號(hào)表達(dá)較少，因而可能逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。可以將一些與免疫識(shí)別有關(guān)的基因（如HLA、B7等）轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)照射后再植入患者體內(nèi)；或?qū)⒈磉_(dá)HLA、B7的病毒載體或質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體復(fù)合物直接注射到瘤體內(nèi)，以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫原性，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫活性。第99頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）制備腫瘤DNA瘤苗許多腫瘤都能表達(dá)一些腫瘤特異的抗原，將這些在正常機(jī)體內(nèi)不表達(dá)的腫瘤特異抗原的編碼基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，通過(guò)其在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)從而可以激發(fā)機(jī)體對(duì)編碼抗原的免疫反應(yīng)。如黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE、酪氨酸酶、癌基因融合基因產(chǎn)物P210bcl-abl和病毒基因產(chǎn)物HPV-E6、E7及癌胚抗原CEA等，這些腫瘤特異性抗原編碼基因可用于制備腫瘤DNA瘤苗。腫瘤DNA瘤苗的轉(zhuǎn)移途徑包括重組病毒感染、直接注射等。第100頁(yè)，共109頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（3）細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)移抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞將細(xì)胞因子基因（如IL-2、IL-4、IL-1、INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF等）導(dǎo)入抗