基因檢測(cè)中病理標(biāo)本DNA提取經(jīng)驗(yàn)總結(jié),醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)論文

基因檢測(cè)中病理標(biāo)本DNA提取經(jīng)驗(yàn)總結(jié),醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)論文隨著分子生物技術(shù)在臨床中開展，其所覆蓋的檢測(cè)疾病的范圍越來越廣，不僅在常規(guī)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，近年來隨著臨床靶向治療的普及，病理腫瘤標(biāo)本的相關(guān)基因檢測(cè)也得到發(fā)展。然而，什么樣的病理標(biāo)本合適做基因檢測(cè)？怎么才能夠得到更多更好的DNA呢？是當(dāng)前我們病理科開展此項(xiàng)目所面對(duì)的問題。經(jīng)過我們不斷實(shí)踐，現(xiàn)將幾點(diǎn)體會(huì)介紹如下。1標(biāo)本及時(shí)適宜的固定是石蠟標(biāo)本基因檢測(cè)的關(guān)鍵步驟活組織或脫落細(xì)胞應(yīng)得到及時(shí)且適宜固定液固定，一般活組織離體30min內(nèi)凍存或10%中性緩沖福爾馬林固定，脫落細(xì)胞應(yīng)及時(shí)離心，-80℃保存或用棉絮紙包裹，按組織常規(guī)處理。適宜固定液及時(shí)固定能夠大大降低DNA的降解，減少基因的片段化，同時(shí)避免使用含重金屬固定液，如Bouin液等。若標(biāo)本固定不佳，在后期的標(biāo)本制備經(jīng)過則無法加于糾正。臨床送檢組織標(biāo)本時(shí)間與固定后標(biāo)本取材時(shí)間之差最好統(tǒng)一，一般為6~48h為好[1,2].活檢小標(biāo)本一般為6~12h,組織大標(biāo)本為6~48h且按要求剖開固定，保證標(biāo)本充分固定，有效保衛(wèi)細(xì)胞中DNA質(zhì)量，提高DNA提取效率，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。2足夠的腫瘤細(xì)胞是石蠟標(biāo)本基因檢測(cè)的必備要求足夠的腫瘤細(xì)胞是基因檢測(cè)DNA提取的基本條件，也是必備要求。在挑取腫瘤組織蠟塊時(shí)，應(yīng)充分地考慮腫瘤細(xì)胞數(shù)量、組織類型及避開壞死組織等。在提取標(biāo)本DNA時(shí)一般應(yīng)首先進(jìn)行病理評(píng)估，了解腫瘤細(xì)胞的數(shù)量、腫瘤細(xì)胞百分比及組織類型，如達(dá)不到病理評(píng)估的要求則應(yīng)終止下游基因檢測(cè)，符合要求進(jìn)行下游檢測(cè)。實(shí)際經(jīng)過中我們可在切取病理石蠟標(biāo)本做DNA提取時(shí)切一張白片用于HE染色于判定腫瘤百分比及腫瘤細(xì)胞數(shù)。如該標(biāo)本已行免疫組化檢測(cè)時(shí)不能將用于常規(guī)病理診斷的HE染色制片中腫瘤細(xì)胞分布情況用于病理評(píng)估，在切取標(biāo)本提取DNA時(shí)再切一張白片用于染色，以免免疫組化檢測(cè)后腫瘤細(xì)胞數(shù)量缺乏，十分是活檢小標(biāo)本。腫瘤細(xì)胞含量的最小比例應(yīng)由不同檢測(cè)方式方法的敏感度決定，專家共鳴以為要求腫瘤細(xì)胞數(shù)一般要求大于200個(gè)，且腫瘤細(xì)胞應(yīng)占整張切片所有細(xì)胞10%以上[2].實(shí)際操作中應(yīng)盡量刮取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域且避開壞死或紅細(xì)胞較多的區(qū)域用于DNA的提取，能夠提取到高質(zhì)量相關(guān)DNA,十分是測(cè)序技術(shù)，同時(shí)可降低PCR擴(kuò)增抑制物的存在。手術(shù)根治標(biāo)本是我們病理基因檢測(cè)的最好標(biāo)本，腫瘤細(xì)胞較多、含量比例高。相反，活檢小標(biāo)本一般腫瘤細(xì)胞數(shù)偏少。如腫瘤細(xì)胞數(shù)量不夠，可多切組織切片彌補(bǔ)腫瘤細(xì)胞缺乏，但應(yīng)保證腫瘤細(xì)胞占整張切片所有細(xì)胞10%以上，如腫瘤細(xì)胞所占比例小于10%,組織標(biāo)本應(yīng)脫蠟后切除無關(guān)細(xì)胞已到達(dá)要求，這樣腫瘤細(xì)胞提取相關(guān)DNA質(zhì)量仍好。同時(shí)應(yīng)對(duì)病理評(píng)估結(jié)果做好記錄，方便與DNA提取結(jié)果進(jìn)行比擬，累積經(jīng)歷體驗(yàn)。3DNA提取是石蠟標(biāo)本基因檢測(cè)的前提條件3.1標(biāo)本的選擇一般選擇病理組織蠟塊保存時(shí)間越短越好。組織標(biāo)本經(jīng)過福爾馬林固定，可引起組織蛋白與核酸交聯(lián)反響。石蠟組織標(biāo)本保存時(shí)間越長(zhǎng)，核酸片段化越嚴(yán)重，加劇核酸甲基化修飾，核酸提取質(zhì)量越差，濃度偏低[3].保存時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本切片時(shí)應(yīng)盡量切掉與空氣接觸的外層組織再切取組織進(jìn)行DNA提取，十分是未行封蠟的組織蠟塊。3.2標(biāo)本的處理石蠟標(biāo)本在進(jìn)行切片前，應(yīng)將切片機(jī)清潔干凈，可用75%乙醇消毒臺(tái)面及鑷子等。每個(gè)標(biāo)本應(yīng)選擇一個(gè)刀口，嚴(yán)格控制標(biāo)本間穿插污染。手術(shù)根治標(biāo)本最好選擇5m~10m切片黏附載玻片上，脫蠟完后用手術(shù)刀轉(zhuǎn)移組織，簡(jiǎn)便、省時(shí)；而活檢小標(biāo)本能夠選擇EP管收集連續(xù)切片，管內(nèi)脫蠟，到達(dá)盡可能收集腫瘤細(xì)胞。在進(jìn)行組織切片時(shí)不建議厚度超過10m或低于5m,過厚組織切片會(huì)增加脫蠟的困難，也增加細(xì)胞酶消化和裂解的難度；過薄則容易產(chǎn)生DNA斷裂。如選擇EP管二甲苯脫蠟時(shí)乙醇去除二甲苯后，應(yīng)晾干方可進(jìn)入下一步驟，殘存有機(jī)溶劑會(huì)降低提取率及后續(xù)擴(kuò)增效率。對(duì)于EP管脫蠟，應(yīng)關(guān)注EP管底至少有肉眼可見的樣本存在，以保證足夠DNA用于下游檢測(cè)。3.3DNA的提取DNA提取一般情況下應(yīng)嚴(yán)格根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的SOP文件執(zhí)行，然而在實(shí)際操作經(jīng)過中往往要對(duì)不同情況進(jìn)行針對(duì)性處理，才能獲得比擬滿意的結(jié)果，筆者歸納如下。3.3.1酶及裂解實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本消化一般用蛋白酶K,其濃縮粉末可室溫15~30℃保存，分裝完應(yīng)放入-20℃保存。DNA提取操作中首先溫度設(shè)定為56℃蛋白酶K的消化及裂解經(jīng)過，最佳工作消化時(shí)間視標(biāo)本而定，不同的標(biāo)本一般不一樣[4].過量的標(biāo)本含量將影響酶的消化及裂解效果，標(biāo)本含量越多消化及裂解時(shí)間應(yīng)越長(zhǎng)，酶消化完成后應(yīng)檢查酶消化效果，如還有很明顯的組織漂浮物應(yīng)講明樣本參加量偏大應(yīng)適度延長(zhǎng)酶消化時(shí)間。適量加大酶量或延長(zhǎng)消化時(shí)間有助于加強(qiáng)消化裂解作用[5,6].蛋白酶K消化一定要知足DNA釋放完全有效，保證以知足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要DNA的量[7].蛋白酶K消化裂解后進(jìn)入90℃滅活，此階段裂解液對(duì)修飾DNA及釋放DNA進(jìn)一步發(fā)揮作用。3.3.2DNA洗滌DNA洗滌液使用前按要求參加無水乙醇，使其成為合格的DNA洗滌液，否則造成DNA柱上流失，大大降低其濃度。DNA洗滌時(shí)將洗滌液靜置時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制，保證洗滌液與核酸有充分的反響時(shí)間，提高標(biāo)本DNA洗滌效果。3.3.3DNA洗脫洗脫液pH不適宜，將會(huì)減少DNA提取效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0~8.5之間。為了提高DNA洗脫效率，可在參加洗脫液后在室溫靜置至少3min以上，腫瘤細(xì)胞偏少應(yīng)5min以上，再按要求離心。參加洗脫液量可根據(jù)我們病理評(píng)估及基因檢測(cè)要求量的結(jié)果適度加減，超過200l洗脫體積所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少。建議活檢小標(biāo)本DNA洗脫液體積應(yīng)小于100l.4DNA定量提取的DNA應(yīng)經(jīng)過定量以保證足夠適量的DNA含量用于下游突變檢測(cè)。DNA提取后應(yīng)立即進(jìn)行DNA濃度測(cè)定，隨后存儲(chǔ)DNA樣本?？衫梅止夤舛扔?jì)在260nm處光密度值和銀光染料法DNA總量檢測(cè),OD260nm/OD280nm比值可直觀判定基因的純度，一般值為1.8~2.0較好，該方式方法較簡(jiǎn)便，但無法評(píng)估可擴(kuò)增的DNA片段和PCR抑制物。若DNA含量確實(shí)不符合檢測(cè)要求應(yīng)終止進(jìn)一步檢測(cè)，以節(jié)約成本和時(shí)間。綜上所述，在病理石蠟標(biāo)本基因檢測(cè)DNA提取中，我們應(yīng)盡量了解每個(gè)步驟的作用以及學(xué)會(huì)怎樣控制石蠟標(biāo)本DNA提取的關(guān)鍵點(diǎn)，這是對(duì)石蠟標(biāo)本基因檢測(cè)的操作者必備要求，也是怎樣防止假陽性假陰性結(jié)果的出現(xiàn)而采取了質(zhì)量保證措施，同時(shí)也是我們病理科開展基因檢測(cè)項(xiàng)當(dāng)前提[8].以下為參考文獻(xiàn)[1]中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變檢測(cè)專家組。中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變檢測(cè)專家共鳴[J].中華病理學(xué)雜志，2018,40〔10〕：700-702.[2]衛(wèi)生部病理質(zhì)控與評(píng)價(jià)中心，結(jié)直腸癌KRAS基因突變檢測(cè)專家組。中國(guó)結(jié)直腸癌KRAS基因突變檢測(cè)專家共鳴[J].中華病理學(xué)雜志，2020,41〔9〕：635-636.[3]李丹，劉亞麗，劉靜，等。石蠟組織存放時(shí)間對(duì)提取DNA質(zhì)量的影響[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)〔醫(yī)學(xué)版〕，2020,33〔1〕：9-13.[4]陳順平。FISH中酶消化細(xì)胞的幾點(diǎn)體會(huì)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2018,26〔1〕：116-117.[5]SengvenB,BarisE,OygurT,etal.ComparisonofmethodsfortheextractionofDNAfromformalin-fixed,paraffin-embeddedarchivaltissues[J].IntJMedSci,2020,11〔5〕：494-503.[6]王卡娜，李紅芳，楊