第二章 電離輻射的分子生物學效應73

第二章

電離輻射的分子生物學效應第四節(jié)

DNA輻射損傷的修復及其

遺傳學控制亞致死損傷修復（sublethaldamagerepair,SLDR）：將預定的照射劑量分次給予，生物效應明顯減輕，表明在兩次照射間隔中細胞有所修復，這種修復稱作SLDR潛在致死性損傷修復（potentiallylethaldamagerepair,

PLDR)：照射后改變細胞所處的狀態(tài)和環(huán)境，如延長接種或給予不良的營養(yǎng)和環(huán)境條件，均能提高存活率。一、不同類型DNA損傷的修復1、DNA單鏈斷裂的修復

絕大多數(shù)正常細胞都能修復單鏈斷裂DNA修復與時間呈指數(shù)關(guān)系，修復速率依賴于溫度與SLDR有關(guān)CHO細胞DNA單鏈斷裂重接修復曲線2、DNA雙鏈斷裂的修復斷裂后即刻，細胞內(nèi)酶修復系統(tǒng)啟動。修復速率的快慢與水平的高低直接決定損傷的殘留以及細胞的轉(zhuǎn)歸。（部分修復：早期修復快，隨后修復的慢）與PLDR有關(guān)X線(20Gy)照射后三株細胞的DNA雙鏈斷裂修復○人成纖維細胞，▲CHO,●人腎癌細胞TO253、堿基損傷的修復種類多，分析較困難以嘧啶二聚體為模型，能修復但只能部分修復。DNA修復合成

DNA期外合成或程序外DNA合成（unscheduledDNAsynthesis,UDS）：DNA合成適于損傷后即刻，隨時間延長而增加，但與細胞周期沒有關(guān)系，是一種修復合成。二、DNA的損傷修復機制1、回復修復細胞對DNA的某些損傷可以用很簡單的方式加以修復在單一基因產(chǎn)物的催化下，一步反應就可以完成。這種修復方式叫回復。1）酶學光復活光復活酶或DNA光解酶

它的作用分成三個步驟：①酶與DNA中的二聚體部位相結(jié)合；②吸收波長為260～380nm的近紫外光，酶被激活，使二聚體解聚；③酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復正常結(jié)構(gòu)。2）DNA單鏈斷裂重接

DNA單鏈斷裂中有一部分是通過簡單的重接而修復的，只需要一種酶——DNA連接酶(ligase)參加，因此也屬于直接回復。DNA連接酶能催化DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中一條鏈缺口處的5’磷酸根與相鄰的一個3’羥基形成磷酸二酯健。連接所需的能量ATP(如動物細胞)。3）嘌呤的直接插入嘌呤插入酶受損嘌呤→APS

→插入嘌呤（糖苷鍵）糖基化酶嘌呤插入酶K+2、切除修復

將損傷的部位（或連同其附近的一定部位）切除，然后用正確配對的、完好的堿基替代修復。有多種酶和基因參與過程：識別（損傷位點）→切除→修復（補）→連接酶和蛋白質(zhì)DNA聚合酶DNA連接酶1)堿基切除：

特點是切除受損傷的堿基。主要過程是水解受損傷的堿基與脫氧核糖磷酸鏈之間的N—糖苷鍵。反應由一類糖基化酶催化。也即：糖基化酶→APS→內(nèi)、外切酶去除殘基。整個修復過程可分以下幾步。2）核甘酸切成（一段寡核苷酸）首先由一個酶系統(tǒng)識別損傷；然后在損傷兩側(cè)各水解一個磷酸二酯鍵；釋放出一段寡核苷酸；填補缺損區(qū)連接酶重新完成連接。E．coli的核苷酸切除修復機理。在E．coli中，UvrA，UvrB，UvrC三種蛋白是必需的。而且必須同時存在才能發(fā)揮作用，所以也叫UvrABC切除核酸酶。UvrA是一種腺苷三磷酸酶，是損傷識別蛋白。它與UvrB結(jié)合成A2B1復合物，結(jié)合在損傷區(qū)，使DNA解旋、扭曲，并引起UvrB構(gòu)象改變，與損傷部位形成緊密的結(jié)合。然后UvrA與UvrB—DNA復合物解離，后者成為UvrC特異結(jié)合靶。UvrB在損傷的3’側(cè)作一內(nèi)切，隨而復合物構(gòu)象改變，UvrC得以在5’側(cè)作第二個切口。解旋酶Ⅱ(UvrD)使寡聚核苷酸片段及UvrC從DNA鏈上釋放，然后DNA聚合酶Ⅰ取代UvrB。修補缺損區(qū)；最后由連接酶連接補片。3、損傷的“耐受”

DNA分子的損傷有時不能立即修復。特別是在復制已經(jīng)開始，而損傷又在復制叉附近時，細胞會通過另一些機制，使復制能進行下去，待復制完成后，再通過某種機制修復殘留的損傷。復制時損傷并未消除，故稱“耐受”包括重組修復（復制后修復）、SOS修復1）、重組修復當DNA雙鏈發(fā)生嚴重損傷時需要另一種機理來完成正確的修復。一種情況是兩條鏈同時受到損傷；另一種情況是單鏈損傷尚未修復時發(fā)生了復制，造成對應于損傷位置的新鏈缺乏正確模板；此時需要重組酶系將另一段未受損傷的雙鏈DNA移到損傷位置附近，提供正確的模板，進行重組。這便是重組修復。3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DNA損傷后重組修復2）SOS修復

細胞DNA受到損傷或復制系統(tǒng)受到抑制，產(chǎn)生一種調(diào)控信號，解除對許多基因的抑制，這些基因的產(chǎn)物參與修復過程。SOS修復過程是在損傷信號誘導下發(fā)生的，又稱可誘導的DNA修復修復過程容易發(fā)生錯誤，故又稱易錯修復SOS修復4、錯配修復錯配修復是生物維持生命、保持物種穩(wěn)定的—種重要功能。從細菌、酵母直至哺乳動物都普遍具有此修復機理。在修復、重組的過程中或外界損傷因子的作用下都有可能發(fā)生錯配。在修復過程中首先要識別錯配堿基對。然后需要分辨錯配的哪一側(cè)屬于母鏈，哪一側(cè)屬于新合成的錯誤鏈。最后修復。錯配糾正過程是很復雜的，至少需要10種活性因子參加。損傷DNA的切除修復

三、基因組修復的不均一性特點1）轉(zhuǎn)錄活性DNA修復優(yōu)于靜止的基因2）轉(zhuǎn)錄鏈優(yōu)于非轉(zhuǎn)錄鏈－修復與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)1、重復序列中的DNA修復靈長類細胞基因組中存在一種高度重復順序，在非洲綠猴細胞中此順序占總DNA的15％一20％，堿基組成與總DNA相近，長度為172bP，沒有轉(zhuǎn)錄功能。

綠猴細胞經(jīng)損傷因子處理后αDNA與主體DNA修復合成的比值損傷因子αDNA/主體DNAUV2540.84NA-AAF0.59AMT0.27異補骨脂內(nèi)酯0.29NA-AAF:N-乙氧基－2－乙酰氨基芴AMT：4’－氨基甲基三甲呋苯吡喃酮2、活性基因中的修復CHO細胞基因組中不同部位的DNA切除修復照射劑量，修復時間探測片段ESS清除率（J/m2）（h）（％）524總DNA16108DHFR基因58208DHFR基因472026DHFR基因722085’上游順序10*ESS代表酶敏感位點，實際上間接反映嘧啶二聚體的存在二氫葉酸還原酶（DHFR）的基因代表活性基因5’端上游順序代表無轉(zhuǎn)錄活性片段。四、DNA修復基因1、原核細胞的修復基因占基因組總量1％。2、酵母有三組RAD基因（radiationsensitive的前三個字母）3、人類基因：1）XRCC（X-rayrepaircrosscomplementing）基因；2）ERCC第五節(jié)輻射所致RNA結(jié)構(gòu)與功能的變化RNA的種類1、核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)2、信使RNA（messengerRNA,mRNA)3、轉(zhuǎn)運RNA(transferRNA,tRNA)*真核細胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，一類分子大小不均一的核RNA－不均一核RNA(hn-RNA)輻射對RNA生物合成的總趨勢：

RNA合成抑制程度<DNA合成抑制程度不同的RNA合成敏感性不同，核內(nèi)RNA敏感性>胞漿內(nèi)RNA一、輻射對總RNA生物合成的影響RNA合成過程體外照射細胞照射整體照射RNA聚合物＋增多核內(nèi)>胞漿減弱DNA特異部位導入RNA鏈上增多相似第一個核甘酸鏈延伸阻止相似釋放出新的RNA鏈和減少相似RNA聚合酶二、輻射對幾種主要RNA的影響1、不均一核RNA（hnRNA)和mRNA

hnRNA：分子大小不均一90％核內(nèi)代謝10％轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA輻射效應對基因組中等重復和單一順序區(qū)最為明顯單一順序區(qū)含大部分蛋白質(zhì)基因中等重復順序區(qū)含組蛋白、tRNA和rRNA基因hnRNA及其產(chǎn)物mRNA堿基順序改變后果嚴重2、tRNAtRNA前體由RNA聚合酶Ⅲ合成聚合酶對射線敏感tRNA對射線不敏感3、rRNA沉降系數(shù)越大對射線約敏感第六節(jié)蛋白質(zhì)和酶的輻射生物效應一、輻射對蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)和功能的影響1、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（primarystucture)肽鍵1、多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序2、基因上遺傳密碼的排列順序決定的3、通過肽鍵連接

即：每一種蛋白質(zhì)分子都有自己特有的氨基酸的組成和排列順序即一級結(jié)構(gòu)，由這種氨基酸排列順序決定它的特定的空間結(jié)構(gòu)，也就是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的二級三級等高級結(jié)構(gòu)，這就是榮獲諾貝爾獎的著名的Anfinsen

原理。胰島素的一級結(jié)構(gòu)及不同動物胰島素在A鏈中的差異蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）

多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是多肽鏈局部的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象），主要有α－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角等幾種形式，它們是構(gòu)成蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的基本要素。

RNase的某些二級結(jié)構(gòu)

三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）

主要針對球狀蛋白質(zhì)而言是指整條多肽鏈由二級結(jié)構(gòu)元件構(gòu)建成的總?cè)S結(jié)構(gòu)，包括一級結(jié)構(gòu)中相距遠的肽段之間的幾何相互關(guān)系,骨架和側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子的空間排列。球狀蛋白質(zhì)，側(cè)鏈基團的定位是根據(jù)它們的極性安排的蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象是由氫鍵、離子鍵、偶極與偶極間的相互作用、疏水作用等作用力維持的，疏水作用是主要的作用力。有些蛋白質(zhì)還涉及到二硫鍵。胰島素的三級結(jié)構(gòu)

溶菌酶分子的三級結(jié)構(gòu)

四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）

四級結(jié)構(gòu)是指在亞基和亞基之間通過疏水作用等次級鍵結(jié)合成為有序排列的特定的空間結(jié)構(gòu)。亞基通常由一條多肽鏈組成，有時含兩條以上的多肽鏈，單獨存在時一般沒有生物活性。血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)1、輻射對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響

一級結(jié)構(gòu)主要是肽鍵斷裂，其次巰基氧化、二硫鍵還原、旁側(cè)羥基被氧化等。高級結(jié)構(gòu)主要是肽鍵氫鍵、側(cè)鏈氫鍵、離子鍵和疏水鍵的改變。一級結(jié)構(gòu)的改變必然影響高級結(jié)構(gòu)，導致蛋白質(zhì)的功能改變，酶活性改變。二、輻射對蛋白質(zhì)和酶生物合成的影響

DNA→→→mRNA→→→Protein輻射對DNA復制和轉(zhuǎn)錄的影響均可不同程度的影響蛋白質(zhì)合成，對其翻譯過程產(chǎn)生效應。抑制與激活并存

三、輻射對蛋白質(zhì)分解代謝的影響分解代謝增強：IR→細胞溶酶體破壞→組織蛋白酶釋放→Pr降解↑蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物↑如：尿中肌酸、牛黃酸、尿素等↑第九節(jié)輻射致癌的分子基礎(chǔ)目前明確認識到：1、DNA是主要的靶分子（致癌過程）2、腫瘤的發(fā)生起源于單細胞突變3、腫瘤的發(fā)生過程伴有遺傳學的變化(Ph1）4、腫瘤的發(fā)生是多階段過程：包括：啟動→促進→發(fā)展5、輻射致癌和化學致癌的機理不同：前者誘發(fā)細胞突變或惡性轉(zhuǎn)變；后者損傷DNA.一、DNA損傷修復和突變

在各種損傷修復中，DSB引起的修復，易導致基因突變。二、癌基因和腫瘤抑制基因1、癌基因＝病毒癌基因＋原癌基因原癌基因（proto-oncogene）：在正常細胞內(nèi)，調(diào)控細胞增殖和分化的重要基因，當受到物理、化學、病毒等生物因素作用被活化而失調(diào)時，才會導致正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化。原癌基因發(fā)生異常，使細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化→細胞癌基因（c-onc）原癌基因的激活：原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎┗虻倪^程。原癌基因的激活方式：①插入激活；②點突變（piontmutation)；③基因擴增；④染色體易位；⑤兩種以上癌基因聯(lián)合作用原癌基因激活的可能途徑

原癌基因的產(chǎn)物

2、腫瘤抑制基因（tumorsuppressorgene)

又稱抗癌基因正常情況下，調(diào)控細胞生長與增殖，這些基因的產(chǎn)物限制細胞生長，功能喪失可導致細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。腫瘤抑制基因的兩個等位基因都發(fā)生突變或丟失（純合型丟失），其功能喪失。如：Rb基因p53基因復習題一、請寫出下列專業(yè)名詞的英文縮寫及全稱1、單鏈斷裂2、雙鏈斷裂3、酶敏感位點4、DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)5、空斑形成能力6、亞致死損傷修復7、潛在致死損傷修復二、名詞解釋1、轉(zhuǎn)化2、亞致死損傷修復3、潛在致死損傷修復4、程序外DNA合成（UDS）5、回復修復6、重組修復7、SOS修復8、原癌基因9、腫瘤抑制基因10、DNA變性三、簡答題1、試述輻射引起DNA鏈斷裂的特點。2、影響DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)的因素有哪些？3、試述輻射引起DNA損傷的生物學意義。4、輻射誘導DNA生物合成抑制的機理有哪些？5、請寫出核小體連接區(qū)的輻射敏感性重要的原因。6、試述回復修復的種類及機理。7、目前在輻射致癌的分子機制中，初步認識到的有哪幾點？q!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYu*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZu(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8KbNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x-A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOfRjUmXp!s&w)z0C4F