核酸電泳與檢測

核酸電泳與檢測第1頁/共45頁1.基本原理

瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。(1)電荷效應(yīng)在pH值為8.0～8.3時，DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中,核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時向正極移動。第2頁/共45頁(2)分子篩效應(yīng)在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快；同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，cccDNA＞IDNA＞ocDNA第3頁/共45頁（3）DNA分子的大小在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數(shù)值成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。第4頁/共45頁根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對遷移距離推測待測定的DNA片段的大小第5頁/共45頁如何提高核酸電泳的分辨率？

第6頁/共45頁（4）凝膠電泳的分辨力與凝膠的類型和密度相關(guān)一、凝膠類型1.瓊脂糖凝膠的分辨力在0.2～50Kb之間(＜20kb);可區(qū)分相差loobp的DNA片段，常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。2.聚丙烯酰胺凝膠用于分離5－500bp的片段;垂直裝置進(jìn)行電泳效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開，能容納相對大量的DNA

用于核苷酸多態(tài)性的分析

第7頁/共45頁不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度（％，W/V)DNA分子的有效分離范圍（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2二、凝膠的密度第8頁/共45頁

可以通過提高瓊脂糖的濃度減小凝膠孔徑來提高電泳分辨率?；蛘吒挠镁郾０纺z。還可以降低跑電泳的電壓，增大跑電泳的時間等。如何提高核酸電泳的分辨率？

第9頁/共45頁2.影響DNA在凝膠中遷移速率的因素：

（1）DNA分子的大?。弘p鏈線狀DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)值近似成反比。樣品分子越大，在通過膠孔時的摩擦阻滯力越大，泳動速度越慢。第10頁/共45頁（2）構(gòu)象：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀第11頁/共45頁（3）凝膠濃度：濃度越低，相同核酸分子遷移越快。

凝膠濃度愈低,則凝膠孔徑愈大(但凝膠的強(qiáng)度也愈低)。一般地分子量越大,選用的凝膠濃度應(yīng)越小。

第12頁/共45頁（4）電壓:低電壓時DNA片段遷移率與所用電壓成正比。但隨著電壓上升,不同長度DNA泳動的增加程度不同，分辨率會降低第13頁/共45頁（5）離子強(qiáng)度緩沖液中無離子時,DNA幾乎不移動。而在高離子強(qiáng)度下，導(dǎo)電性極高,帶電顆粒泳動很快,并產(chǎn)生大量的熱,有時甚至熔化凝膠或使DNA變性。第14頁/共45頁電泳緩沖液TAETBETPE三者區(qū)別（1）緩沖容量：TAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化。

TBE和TPE比TAE花費(fèi)貴，但有高得多的緩沖容量。（2）遷移速度：雙鏈線狀DNA片段中TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%，（3）分辨率：對于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點(diǎn)，室溫下貯存5×溶液第15頁/共45頁（5）溴化乙錠

在DNA電泳中,溴化乙錠染料可插入到堿基對中,從而增加線性及開環(huán)DNA的長度。加溴化乙錠后進(jìn)行電泳,可使DNA的泳動速度降低達(dá)15%。第16頁/共45頁3.瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。當(dāng)瓊脂糖加熱至90℃左右,即可熔化形成清亮、透明的液體,待冷至40-45℃時則可固化形成凝膠。第17頁/共45頁基本過程：制膠放入電泳槽中并加入電泳緩沖液取出梳子將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中一定電壓條件下電泳合適的時間后停止電泳取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果

注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時要帶手套第18頁/共45頁（1）瓊脂糖凝膠電泳的基本過程第19頁/共45頁第20頁/共45頁上樣緩沖液的三個作用（1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)（2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程（3）其中的染料在電場中可以預(yù)測泳動速率向陽極遷移。第21頁/共45頁6*上樣緩沖液成分：第22頁/共45頁（2）瓊脂糖凝膠中DNA的檢測

通過染色,紫外燈下檢測。主要有溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。第23頁/共45頁凝膠的EB染色（1）EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì),見光分解。（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸第24頁/共45頁

（3）EB使用時的配制、貯存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml

。（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。第25頁/共45頁EB替代品

SYBRGold是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強(qiáng)熒光信號。第26頁/共45頁sybr-green、sybrgold----不穩(wěn)定，毒性也很大

goldview----宣稱無毒,不靈敏,回收連接不好,熒光易猝滅。對于大片段DNA的染色效果還湊合，但是在對于500bp以下的片段效果不是很好。GelRed/GelGreen低毒,效果很強(qiáng)!但價格昂貴。第27頁/共45頁第28頁/共45頁（3）結(jié)果分析提取細(xì)菌基因組電泳圖第29頁/共45頁瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡過程中

DNALadder的形成PCR產(chǎn)物的電泳第30頁/共45頁RNA電泳圖第31頁/共45頁4.注意事項(xiàng)1、溴乙錠(EB)是誘變劑，應(yīng)戴乳膠手套。凡是沾污過溴乙錠的器皿或物品,必須經(jīng)專門處理后，才能進(jìn)行清洗或棄去。

2、加樣量的多少決定于加樣孔最大容積。加入樣品的體積應(yīng)略少于加樣孔容積。

第32頁/共45頁5.常見問題與對策DNA帶很淡或無帶第33頁/共45頁DNA帶拖尾第34頁/共45頁第35頁/共45頁第36頁/共45頁6.DNA濃度和純度的測定紫外吸收法、定磷法（1）目測條帶亮度來判斷DNA濃度

跑膠時候marker按說明書的量上樣電泳，電泳完畢后，就可將目的DNA條帶和marker條帶的亮度做個大致的比較。

找出兩者最接近亮度的條帶。根據(jù)條帶的亮度、大小大致就可推測目的DNA的濃度。

在通過目測DNA濃度的時候，最好要把加樣量設(shè)一個梯度，如果質(zhì)粒的量很濃的話。

第37頁/共45頁（2）分光光度法

DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。對標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1μg/ml時，DNA鈉鹽的OD260＝0.02當(dāng)OD260＝1時，dsDNA濃度約為50μg/ml

ssDNA濃度約為37μg/ml

RNA濃度約為40μg/ml

寡核苷酸濃度約為30μg/ml（由于底物不同有差異第38頁/共45頁當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測定。一般情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230，計算其比值來衡量樣品的純度。第39頁/共45頁經(jīng)驗(yàn)值：純DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）純RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時表明可能有異硫氰酸殘存）若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時無法用分光光度法對核酸進(jìn)行定量，可使用方案二的方法或其他方法進(jìn)行估算。

第40頁/共45頁操作步驟1、

UV-240紫外分光光度計開機(jī)預(yù)熱10min.2、

用重蒸水洗滌比色皿，吸水紙吸干，加入TE緩沖液后，放入樣品室的S池架上，關(guān)上蓋板。3、

設(shè)定狹縫后校零。4、

將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品適當(dāng)稀釋（DNA5μl或RNA4μl用TE緩沖液稀釋至1000μl）后，記錄編號和稀釋度。5、

把裝有標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測樣品的比色皿放進(jìn)樣品室的S架上，關(guān)閉蓋板。6、

設(shè)定紫外光波長，分別測定230nm、260nm、280nm波長時的OD值。7、

計算待測樣品的濃度與純度。DNA樣品的濃度（μg/μl）:OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000RNA樣品的濃度（μg/μl）：OD260×稀釋倍數(shù)×40/1000第41頁/共45頁（3）溴化乙錠法溴化乙錠（EB）插入堆積堿基之間。結(jié)合的EB的熒光產(chǎn)率遠(yuǎn)大于游離EB的熒光產(chǎn)率。熒光強(qiáng)度正比于嵌入溴化乙錠的量。EB結(jié)合量的多少與DNA的大小和構(gòu)型有關(guān)，對于單一構(gòu)型的同種DNA樣品來說，溴化乙錠的嵌入量與樣品溶液的DNA含量成正比。第42頁/共45頁

基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對RNA酶的作用非