非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌

第十一章非發(fā)酵革蘭陰性桿菌一、教學(xué)大綱要求非發(fā)酵菌的概念、種類和初步鑒定特征。假單胞菌屬的分類、臨床意義、細(xì)菌特性、實(shí)驗(yàn)室檢查和耐藥性。銅綠假單胞菌的臨床意義、細(xì)菌特性、實(shí)驗(yàn)室檢查和耐藥性。熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、斯氏假單胞菌的臨床意義、細(xì)菌特性和實(shí)驗(yàn)室檢查。不動(dòng)桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬和軍團(tuán)菌的臨床意義、細(xì)菌特性、實(shí)驗(yàn)室檢查和耐藥性。黃桿菌屬和莫拉菌屬的細(xì)菌特性和實(shí)驗(yàn)室檢查。二、教材內(nèi)容精要非發(fā)酵菌的主要特點(diǎn)和分類非發(fā)酵菌(NonfermentativeBacilli)是一群不發(fā)酵葡萄糖或僅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厭氧、無芽胞的革蘭陰性桿菌；在分類學(xué)上分別屬于不同的科、屬和種，但生化特征十分接近，多為條件致病菌，主要引起院內(nèi)感染。非發(fā)酵菌包括的菌種較多，主要有下列菌屬：假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、伯克菌屬(Burkholderia)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、無色桿菌屬(Achromobacter)、莫拉菌屬(Moraxella)、金氏桿菌屬(Kingella)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、艾肯菌屬(Eikenella)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、食酸菌屬(Acidovorax)等。若某種未知的革蘭陰性桿菌具有以下一種或幾種特征，則懷疑其為非發(fā)酵菌：氧化發(fā)酵試驗(yàn)常顯示是氧化型或產(chǎn)堿型。氧化酶陽性，非發(fā)酵菌中，除不動(dòng)桿菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌外氧化酶試驗(yàn)均為陽性。但并非所有氧化酶陽性的革蘭陰性桿菌都是非發(fā)酵菌，如巴斯德菌、氣單胞菌、鄰單胞菌和弧菌屬等也是氧化酶陽性但不是非發(fā)酵菌。動(dòng)力，非發(fā)酵菌大部分為專性需氧菌，在半固體培養(yǎng)基上觀察動(dòng)力不明顯，可用懸滴法或鞭毛染色法檢測(cè)其動(dòng)力。假單胞菌屬假單胞菌屬(Pseudomonas)為嚴(yán)格需氧、有鞭毛、無芽胞、無莢膜的革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)均陽性，是假單胞菌科的代表菌屬。分類假單胞菌科由假單胞菌屬及其親緣關(guān)系密切的菌屬(以前大部分屬于假單胞菌屬)組成，用于假單胞菌科分類的方案有兩個(gè)，一是根據(jù)細(xì)菌的表型特征分為7個(gè)主要的組，二是根據(jù)rRNA-DNA同源研究將假單胞菌科分為5個(gè)rRNA群。盡管假單胞菌科的絕大部分細(xì)菌原先都被歸類于假單胞菌屬，但現(xiàn)在只有rRNAI群的細(xì)菌屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，包括銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、斯氏假單胞菌、曼多辛假單

胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌和假產(chǎn)堿假單胞菌7種細(xì)菌。rRNAlI群的細(xì)菌屬于伯克菌屬(Burkhokderia)，包括13個(gè)種，其中類鼻疽伯克菌、蔥頭伯克菌、唐菖蒲伯克菌和皮氏伯克菌與人類疾病相關(guān)。鼻疽伯克菌是動(dòng)物專性寄生菌，在極少數(shù)情況下可傳播給人(通常通過皮膚的磨損)，是本菌屬中唯一無動(dòng)力的種，本屬其他菌種與植物有關(guān)而與人類疾病無關(guān)。rRNAlII群的細(xì)菌屬于叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)，本科包括兩個(gè)菌屬：叢毛單胞菌屬(Comamonas)和食酸菌屬(Acidovorax)，前者包括土生叢毛單胞菌等三個(gè)菌種，后者包括敏捷食酸菌等三個(gè)菌種。rRNAW群屬于短波單胞菌屬(Brevundimonas)，包括兩個(gè)菌種：缺陷短波單胞菌和泡囊短波單胞菌。rRNAV群的細(xì)菌屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，只有一個(gè)菌種嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。細(xì)菌特性假單胞菌屬是一類無芽胞、有莢膜、散在排列的革蘭陰性桿菌，菌體直或微彎、有單鞭毛或叢鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑；專性需氧，生長(zhǎng)溫度范圍廣，最適生長(zhǎng)溫度35°C，少數(shù)細(xì)菌可在4°C或42^生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求不高，普通培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)；氧化利用葡萄糖，氧化酶、觸酶試驗(yàn)陽性，麥康凱上可生長(zhǎng)。除曼多辛假單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌和假產(chǎn)堿假單胞菌外，假單胞菌屬的細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中可產(chǎn)生各種水溶性色素，主要為黃綠色的綠膿素、青膿素等。臨床意義人類非發(fā)酵菌感染中，假單胞菌占70%?80%，主要為銅綠假單胞菌，其他較為常見的菌種有鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌等。微生物學(xué)檢驗(yàn)(1)檢驗(yàn)程序見圖11-1。醫(yī)院環(huán)境用品、臨床標(biāo)本肉湯培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基k血平板麥康凱平板I|I可疑菌落OF試驗(yàn)涂片革蘭染色革蘭陰性桿菌、氧化酶陽性革蘭陰性桿菌、氧化酶陽性非發(fā)酵菌系列生化反應(yīng)鑒定到種產(chǎn)綠膿素、青膿素42C生長(zhǎng)、極端單鞭毛乙酰胺酶陽性銅綠假單胞菌圖11-1非發(fā)酵菌檢驗(yàn)程序（2）標(biāo)本采集根據(jù)感染部位不同分別采集痰液、分泌物、尿液以及醫(yī)院環(huán)境用品等。（3）檢驗(yàn)方法非發(fā)酵菌鑒定較為復(fù)雜，應(yīng)先進(jìn)行初步分群（屬），然后再進(jìn)行種的鑒定。初步分群的常用實(shí)驗(yàn)為葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)（O/F試驗(yàn)）、氧化酶試驗(yàn)、動(dòng)力觀察。再進(jìn)一步作生化試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定。耐藥性假單胞菌屬的細(xì)菌對(duì)有些抗生素天然耐藥，臨床治療假單胞菌感染的抗菌藥物主要有三類：8內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類。按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards，NCCLS）推薦，非腸桿菌科細(xì)菌除銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌屬外，藥敏試驗(yàn)不選用Kirby-Bauer法，應(yīng)選用肉湯或瓊脂稀釋法或E-test法。（三）銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）是假單胞菌屬的代表菌種，廣泛分布于自然界和人體，其在外界環(huán)境中存在的重要條件是潮濕環(huán)境；為條件致病菌，主要引起醫(yī)院內(nèi)感染。1.細(xì)菌特性（1）形態(tài)染色革蘭陰性桿菌，菌體呈球桿狀或長(zhǎng)絲狀，長(zhǎng)短不一；單個(gè)、呈雙或短鏈狀排列；無芽胞，有莢膜，一端有單鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，臨床分離株常有菌毛。（2）培養(yǎng)特性專性需氧菌，部分菌株能在兼性厭氧環(huán)境中生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，可生長(zhǎng)溫度范圍是25°C?42°C，最適生長(zhǎng)溫度35°C，4°C不生長(zhǎng)而42°C生長(zhǎng)是該菌的鑒別點(diǎn)之一。在血平板、麥康凱平板上均可形成5種不同形態(tài)的菌落：①典型型，菌落呈灰綠色，大小不一，扁平濕潤(rùn)，邊緣不規(guī)則，呈傘狀伸展，表面?？梢娊饘俟鉂?；②大腸菌樣型，菌落圓形凸起，灰白色半透明，似大腸埃希菌菌落；③黏液型，菌落光滑凸起，呈黏液狀；④侏儒型，細(xì)小，無光澤半透明菌落；⑤粗糙型，菌落中央凸起，邊緣扁平，表面粗糙。在血平板上?？梢娡该魅苎h(huán)，有生姜?dú)馕?；在液體培養(yǎng)基中呈混濁生長(zhǎng)，表面可形成菌膜，在SS瓊脂平板上，該菌經(jīng)過24h培養(yǎng)形成較小無色半透明菌落，一般不易與沙門菌和志賀菌菌落相區(qū)別，但經(jīng)48h培養(yǎng)菌落中央呈棕綠色。銅綠假單胞菌在普通瓊脂平板上生長(zhǎng)時(shí)，可產(chǎn)生多種色素，主要為綠膿素（為銅綠假單胞菌特征性色素）和青膿素（熒光素）前者為藍(lán)綠色。從臨床標(biāo)本分離的銅綠假單胞菌約有80%?90%產(chǎn)生綠膿素和青膿素。（3）生化反應(yīng)氧化酶陽性，在OF培養(yǎng)基上，能氧化利用葡萄糖、木糖產(chǎn)酸，精氨酸雙水解酶陽性，乙酰胺酶陽性，液化明膠，利用枸櫞酸鹽，還原硝酸鹽并產(chǎn)生氮?dú)?，吲哚陰性。?）抗原構(gòu)造銅綠假單胞菌有菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原、黏液（S）抗原和菌毛抗原。O抗原有兩種成分：一種是外膜蛋白，為保護(hù)性抗原，免疫性強(qiáng)，具有屬特異性；另一種為脂多糖（LPS），具有型特異性，可用于細(xì)菌分型。

抵抗力銅綠假單胞菌對(duì)外界因素的抵抗力比其他無芽胞菌強(qiáng)，在潮濕的環(huán)境中能長(zhǎng)期生存。對(duì)干燥、紫外線有抵抗力，但對(duì)熱抵抗力不強(qiáng)，臨床分離菌株對(duì)多種抗生素不敏感。臨床意義銅綠假單胞菌可從醫(yī)院內(nèi)許多消毒不嚴(yán)的器皿和溶液中分離出來，常見為水溶液包括洗滌水、消毒液和液體藥物等。醫(yī)院內(nèi)銅綠假單胞菌所致的肺部感染常見的入侵途徑是霧化吸入、氧氣吸入，各種侵襲性檢查和治療，如纖維支氣管鏡、導(dǎo)管、膽道、手術(shù)后引流等，破壞了機(jī)體皮膚或黏膜屏障，常引起本菌侵襲。嚴(yán)重銅綠假單胞菌感染常發(fā)生在局部組織損傷或抵抗力降低的患者，如燒傷病人、各種癌腫患者和應(yīng)用廣譜抗生素、激素、抗腫瘤藥及免疫抑制劑等患者；早產(chǎn)、先天畸形兒童和囊性纖維化等疾病及老年患者，也易發(fā)生嚴(yán)重的銅綠假單胞菌感染。銅綠假單胞菌的致病作用與多種毒力因子有關(guān)，主要有以下幾種：黏附和定植形成黏附的條件包括：①銅綠假單胞菌表面的莢膜多糖物質(zhì)阻止白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的吞噬作用；②細(xì)菌表面的黏附素(主要是菌毛)和上皮細(xì)胞上存在的相應(yīng)受體結(jié)合；③宿主防御機(jī)制異常。后者使細(xì)菌得以駐足，并保持和上皮細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間的接觸。完整的皮膚黏膜是天然的屏障，故銅綠假單胞菌很少成為健康人的原發(fā)病原菌，但改變或損傷宿主正常的防御機(jī)制，如皮膚黏膜破壞、留置導(dǎo)尿管、氣管切開插管或免疫機(jī)制缺損如粒細(xì)胞缺乏、低蛋白血癥、各種腫瘤患者、應(yīng)用激素和廣譜抗生素的患者，?？蓪?dǎo)致感染。燒傷焦痂、嬰兒或兒童的皮膚、臍帶和腸道、老年人的尿道則是較常見的原發(fā)病灶或入侵門戶。如果人體抵抗力降低或細(xì)菌毒力強(qiáng)，數(shù)量多，就可在血中生長(zhǎng)繁殖，發(fā)生敗血癥。外毒素A為主要毒力因子，是銅綠假單胞菌產(chǎn)生的最強(qiáng)有力毒素，可抑制蛋白質(zhì)合成，對(duì)皮膚黏膜有壞死作用，約90%菌株產(chǎn)生外毒素A，在燒傷病人，其致死作用特別突出。其他尚有蛋白酶、胞外酶S、溶血素、腸毒素、色素、殺白細(xì)胞素、內(nèi)毒素等。微生物學(xué)檢驗(yàn)檢驗(yàn)程序見圖11-2。血液、環(huán)境用品分泌物、穿刺液、痰、尿、胸腹水等肉湯增菌―分離培養(yǎng)直接涂片、革蘭染色、鏡檢(血平板、麥康凱)35°C18?血液、環(huán)境用品分泌物、穿刺液、痰、尿、胸腹水等肉湯增菌―分離培養(yǎng)直接涂片、革蘭染色、鏡檢(血平板、麥康凱)35°C18?24h初步鑒定最后鑒定革蘭陰性桿菌氧化酶陽性革蘭陰性桿菌氧化酶陽性菌落特征氣味色素生化42C分型鑒定反應(yīng)生長(zhǎng)(血清學(xué)綠膿素噬菌體）葡萄糖OF:O精氨酸水解酶+乙酰胺酶+明膠液化+報(bào)告圖11-2銅綠假單胞菌檢驗(yàn)程序（2）標(biāo)本采集按疾病和檢查目的分別采取不同的臨床標(biāo)本，如傷口分泌物、尿液、膿及穿刺液、血液、腦脊液、胸腹水、關(guān)節(jié)液等。醫(yī)院環(huán)境檢測(cè)可從空氣、水、物體表面等處采樣。（3）.檢驗(yàn)方法1）顯微鏡檢查腦脊液、胸腹水離心后取沉淀物涂片，綠色膿汁、分泌物直接涂片革蘭染色鏡檢。為革蘭陰性桿菌，有鞭毛。2）分離培養(yǎng)血液和體液標(biāo)本可先增菌后在轉(zhuǎn)種血瓊脂平板和麥康凱平板，膿液、分泌物、中段尿等可直接接種上述培養(yǎng)基。3）鑒定與鑒別根據(jù)培養(yǎng)物的菌落特征、產(chǎn)生水溶性綠色色素、特殊的生姜?dú)馕?、氧化酶試?yàn)、OF試驗(yàn)等即可作出初步鑒定。但對(duì)色素產(chǎn)生不典型的銅綠假單胞菌還需要做其它生化反應(yīng)（如明膠液化、精氨酸雙水解試驗(yàn)、42r生長(zhǎng)試驗(yàn)等，乙酰胺酶檢測(cè)試驗(yàn)有一定的價(jià)值，）與其他假單胞菌鑒別。從臨床標(biāo)本中分離出銅綠假單胞菌，需要排除污染，從患者血及無菌體液、尿液中分離到本菌，特別是反復(fù)檢出者，結(jié)合臨床表現(xiàn)即可確定是感染病原菌，銅綠假單胞菌下呼吸道感染需連續(xù)三次痰培養(yǎng)陽性才能確立，如患者無感染的臨床表現(xiàn)，雖然分離到銅綠假單胞菌亦應(yīng)作為正常菌群。（4）耐藥性銅綠假單胞菌對(duì)多數(shù)抗生素不敏感，呈現(xiàn)明顯的固有耐藥性。長(zhǎng)期以來假單胞菌的固有耐藥性認(rèn)為是由于該菌具有外膜的低通透性（主要是外膜微孔蛋白突變，阻止抗生素由外膜進(jìn)入胞質(zhì)）最近的研究表明，假單胞菌耐藥的產(chǎn)生機(jī)制與細(xì)菌具有能量依賴性的主動(dòng)外排系統(tǒng)有關(guān)，也可能同時(shí)存在其他耐藥機(jī)制。由于在長(zhǎng)期抗生素治療過程中銅綠假單胞菌可能發(fā)生耐藥，因此，初代敏感的菌株在治療3~4周后，測(cè)試重復(fù)分離株的抗生素敏感性是必要的。目前，對(duì)假單胞菌感染多采用聯(lián)合治療，如選用一種5內(nèi)酰胺類抗生素與一種氨基糖苷類或一種喹諾酮類抗菌藥物聯(lián)合治療嚴(yán)重的銅綠假單胞菌感染。（四）熒光假單胞菌1.細(xì)菌特性革蘭陰性桿菌，呈單個(gè)或成對(duì)排列，一端叢毛菌，運(yùn)動(dòng)活潑，偶見無鞭毛無動(dòng)力的菌株。專性需氧，營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，在麥康凱和SS平板上亦可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為25°C?30°C，大多數(shù)菌株在4°C生長(zhǎng)，37C或42C不生長(zhǎng)。約94%的菌株產(chǎn)生水溶性熒光素（青膿素），在紫外線（360nm）照射下呈黃綠色熒光，有些菌株產(chǎn)生藍(lán)色色素，不擴(kuò)散。氧化酶陽性，氧化葡萄糖、木糖產(chǎn)酸，對(duì)麥芽糖多不分解，水解精氨酸，多能液化明膠，卵磷酯酶陽性。本菌對(duì)卡那霉素敏感。臨床意義熒光假單胞菌（P.fluorescens）存在于土壤和水等環(huán)境中，常與食物（雞蛋、血、牛乳等）腐敗有關(guān)，可作為咽部的正常菌群存在，是人類少見的條件致病菌，偶從泌尿道感染病人尿中分離出。由于具有嗜冷性，可在冰箱儲(chǔ)存血液中繁殖，若輸入含有此菌的血庫血液，可導(dǎo)致病人不可逆性的休克而死亡。微生物學(xué)檢驗(yàn)?zāi)?、分泌物等臨床標(biāo)本可直接接種在血平板上，血液標(biāo)本可先于20°C?30°C進(jìn)行增菌后再接種血平板分離。不能在35C或37C進(jìn)行培養(yǎng)，以免發(fā)生假陰性。本菌鞭毛3根以上，42C不能生長(zhǎng)，不產(chǎn)生綠膿素，可以與銅綠假單胞菌相區(qū)別。本菌的最低鑒定特征有：?jiǎn)味吮廾?根以上，動(dòng)力陽性；氧化分解葡萄糖，不分解麥芽糖，氧化酶陽性，精氨酸水解陽性，明膠液化陽性；可產(chǎn)生熒光素，不產(chǎn)生綠膿素，4C生長(zhǎng)，42C不生長(zhǎng)。（五）惡臭假單胞菌1.細(xì)菌特性革蘭陰性桿菌，有些菌株為卵圓形，單端叢毛菌，運(yùn)動(dòng)活潑。專性需氧，最適生長(zhǎng)溫度25C?30C，42C不生長(zhǎng)，4C生長(zhǎng)不定，菌落與銅綠假單胞菌相似，但只產(chǎn)生熒光素（青膿素），不產(chǎn)生綠膿素，借此可與銅綠假單胞菌相區(qū)別，其陳舊培養(yǎng)物有腥臭味。臨床意義惡臭假單胞菌（P.putica）為魚的一種致病菌，常從腐敗的魚中檢出，可作為人類咽部的正常菌群，是人類少見的條件致病菌，偶從人類尿道感染、皮膚感染和骨髓炎標(biāo)本中分離出，分泌物有腥臭味。微生物學(xué)檢驗(yàn)鑒定中注意與其他假單胞菌相區(qū)別，只產(chǎn)生熒光素不產(chǎn)生綠膿素，42C不生長(zhǎng)可與銅綠假單胞菌區(qū)別；不液化明膠、不產(chǎn)生卵磷酯酶、陳舊培養(yǎng)物上有腥臭味，有別于熒光假單胞菌。（六）斯氏假單胞菌細(xì)菌特性革蘭陰性桿菌，一端單鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑；最適生長(zhǎng)溫度35C，4C不生長(zhǎng)，大部分菌株在42C生長(zhǎng)，氧化葡萄糖產(chǎn)酸，在6.5%高鹽培養(yǎng)基中可生長(zhǎng)；營(yíng)養(yǎng)要求不高，普通平板可生長(zhǎng)，新分離菌株在培養(yǎng)基上可形成特征性干燥、皺縮樣菌落，黏附于瓊脂表面難以移動(dòng)，可產(chǎn)生黃色色素，無熒光。臨床意義斯氏假單胞菌（P.stutizeri）存在于土壤和水中，在醫(yī)院設(shè)備及各種臨床標(biāo)本中亦有發(fā)現(xiàn)，本菌引起的感染并不多見，偶可引起抵抗力低下患者傷口、泌尿道、肺部感染等。微生物學(xué)檢驗(yàn)注意與曼多辛假單胞菌相鑒別，其特征性菌落、精氨酸雙水解試驗(yàn)陽性、不分解麥芽糖和甘露醇，有別于曼多辛假單胞菌。（七）不動(dòng)桿菌屬不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）歸于奈瑟菌科，1986年巴斯德研究所的Bouvet等根據(jù)DNA-DNA雜交和營(yíng)養(yǎng)特征將不動(dòng)桿菌分成17個(gè)基因種，但只有6個(gè)基因種有菌名，模式菌是醋酸鈣不動(dòng)桿菌。

1.細(xì)菌特性不動(dòng)桿菌屬為一群不發(fā)酵糖類、氧化酶陰性、硝酸鹽還原陰性、不能運(yùn)動(dòng)的革蘭陰性桿菌。菌體多為球桿狀，常成雙排列，看似雙球菌，有時(shí)不易脫色，可單個(gè)存在，無芽胞、無鞭毛，黏液型菌株有莢膜。專性需氧菌，營(yíng)養(yǎng)要求不高，普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)溫度35。。，可在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落呈無色或淡粉紅色，但在SS上有些菌株生長(zhǎng)不良。臨床意義不動(dòng)桿菌廣泛分布于自然界、醫(yī)院環(huán)境和健康人的皮膚。在臨床標(biāo)本中，最常見的是鮑曼不動(dòng)桿菌，它是僅次于銅綠假單胞菌而居臨床分離陽性率第二位的非發(fā)酵菌，為條件致病菌。醫(yī)院內(nèi)感染最常見的部位是呼吸道、尿道和傷口；致病條件有抗生素治療、手術(shù)、應(yīng)用器械、ICU病房等；所致的疾病包括肺炎、尿路感染、皮膚和傷口感染、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和腹膜炎等。微生物學(xué)檢驗(yàn)（1）檢驗(yàn)程序見圖11-3。尿液、痰液、膿汁直接涂片分離培養(yǎng)革蘭染色（血平板、麥康凱）35°C18?24h鏡檢涂片革蘭染色動(dòng)力KIA全面生化反應(yīng)革蘭陰性球桿菌陰性底層斜面氧化酶陰性不變色最終鑒定可疑菌落鏡檢涂片革蘭染色動(dòng)力KIA全面生化反應(yīng)革蘭陰性球桿菌陰性底層斜面氧化酶陰性不變色最終鑒定報(bào)告圖11-3不動(dòng)桿菌屬檢驗(yàn)程序（2）標(biāo)本采集根據(jù)臨床疾病的不同采集不同的標(biāo)本，常見為痰液、尿液和分泌物。（3）檢驗(yàn)方法1）顯微鏡檢查臨床標(biāo)本采集后先做涂片，革蘭染色后鏡檢，為革蘭陰性球桿菌，常成雙排列，在吞噬細(xì)胞內(nèi)也有存在，易誤認(rèn)為奈瑟菌屬細(xì)菌。2）分離培養(yǎng)在血平板和麥康凱平板上經(jīng)35C?37C培養(yǎng)18h?24h后，可形成圓形、灰白色、光滑、

濕潤(rùn)、邊緣整齊、直徑2?3mm的菌落，無色素形成；洛菲不動(dòng)桿菌菌落較小，直徑為1?1.5mm；溶血不動(dòng)桿菌在血平板上可產(chǎn)生0溶血；有些菌株苛養(yǎng)，在血平板上呈針尖樣菌落，在營(yíng)養(yǎng)肉湯中不生長(zhǎng)；某些氧化葡萄糖的不動(dòng)桿菌可使血平板呈獨(dú)特的棕色。氧化酶陰性，動(dòng)力陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性。3）鑒定與鑒別培養(yǎng)物經(jīng)涂片、染色，如為革蘭陰性成雙排列的球桿菌，形態(tài)似奈瑟菌；KIA底層及斜面均不變色、無動(dòng)力；氧化酶陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，可初步確定為不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌（后三項(xiàng)試驗(yàn)均為陰性者在革蘭陰性桿菌中極為罕見）。本菌屬內(nèi)種的鑒定參見表11-1，并注意與類似菌的鑒別（表11-2）。表11-1不動(dòng)桿菌菌種的鑒別醋酸鈣不動(dòng)桿菌鮑曼不動(dòng)桿菌溶血不動(dòng)桿菌瓊氏不動(dòng)桿菌約氏不動(dòng)桿菌洛菲不動(dòng)桿菌葡萄糖+++或-___木糖_++或-___乳糖++_+++精氨酸雙水解酶++++_或+_鳥氨酸脫羧酶++____苯丙氨酸脫氨酶++____丙二酸鹽利用++___或+_檸檬酸鹽利用++++或_+_溶血__+___液化明膠__+___生長(zhǎng)溫度37°C++++_+41°C_+_+__42C_+____表11-2不動(dòng)桿菌與類似菌的比較醋酸鈣洛菲不銅綠假糞產(chǎn)不動(dòng)桿菌動(dòng)桿菌單胞菌堿桿菌氧化酶__++硫化氫___/+_吲哚____動(dòng)力__++葡萄糖+-+-木糖+-+-乳糖(+)---麥芽糖(+)---甘露醇----蔗糖----精氨酸雙水解酶--+-檸檬酸鹽利用+-++硝酸鹽還原+-/+耐藥性不動(dòng)桿菌均對(duì)青霉素、氨芐西林和頭抱拉啶耐藥；大多數(shù)菌株對(duì)氯霉素耐藥，不同菌株對(duì)二代和三代頭抱菌素的耐藥性不同，所以每個(gè)分離菌株均應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。非發(fā)酵菌中，僅本菌屬細(xì)菌與銅綠假單胞菌可采用Kirby-Bauer法做藥敏試驗(yàn)。多重耐藥最多見于醋酸鈣不動(dòng)桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和溶血不動(dòng)桿菌。寡養(yǎng)單胞菌屬寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)是一個(gè)新命名的菌屬，屬于假單胞菌科的RNA同源群V,只有一個(gè)菌種一一嗜麥芽寡養(yǎng)單抱菌(S.maltophilia)，此菌的名稱先后有嗜麥芽假單胞菌、嗜麥芽黃單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌。1.細(xì)菌特性革蘭陰性桿菌，菌體直或略彎，單個(gè)或成對(duì)排列，一端叢毛菌，有動(dòng)力。最適生長(zhǎng)溫度為35^，4°C不生長(zhǎng)，近半數(shù)菌株42C生長(zhǎng)，專性需氧菌，營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，麥康凱平板可生長(zhǎng)。臨床意義為條件致病菌，主要引起院內(nèi)感染，最常見的是：呼吸道感染、尿道感染、傷口感染，也可引起腦膜炎、菌血癥、醫(yī)源性敗血癥、心內(nèi)膜炎等。引起本菌定植和感染的危險(xiǎn)因素有：機(jī)械通氣、廣譜抗生素的預(yù)防性應(yīng)用、化療、插管和中性粒細(xì)胞減少等。在非發(fā)酵菌引起的感染中，僅次于銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌而居臨床分離陽性率的第三位。微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本采集血液標(biāo)本先肉湯增菌，尿液、痰、胸水、傷口等標(biāo)本直接接種于血平板和麥康凱平板。檢驗(yàn)方法顯微鏡檢查臨床標(biāo)本直接顯微鏡檢查意義不大。細(xì)菌涂片革蘭染色鏡下為短至中等大小的革蘭陰性桿菌；不染色標(biāo)本顯微鏡下動(dòng)力檢查，本菌運(yùn)動(dòng)活躍；鞭毛染色后鏡檢，本菌為一端叢毛菌，多數(shù)菌株鞭毛在3根以上。分離培養(yǎng)在普通瓊脂平板上形成中等大小、圓形、黃色或棕黃色不透明的菌落，在血平板上菌落不溶血，有氨氣味。氧化酶陰性，DNA酶陽性，賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性，葡萄糖氧化分解緩慢，可快速氧化分解麥芽糖，能液化明膠，硝酸鹽產(chǎn)氮?dú)怅幮裕糠志晗跛猁}還原試驗(yàn)陽性。鑒定下列特征可用來推測(cè)性地鑒定嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌：在血平板或麥康凱平板上生長(zhǎng)良好；氧化酶陰性；OF麥芽糖氧化產(chǎn)酸，但OF葡萄糖氧化分解可以陰性或產(chǎn)弱酸性反應(yīng)；賴氨酸脫羧酶陽性、DNA酶陽性；一些菌株產(chǎn)生黃色色素；對(duì)碳青霉烯類抗生素天然耐藥。耐藥性本菌對(duì)大多數(shù)臨床常用的抗生素如氨基糖苷類和很多8內(nèi)酰胺類(包括對(duì)銅綠假單胞菌很有效的抗生素，如碳青霉烯類)天然耐藥，主要與該菌存在一種鋅離子依賴金廓內(nèi)酰胺酶有關(guān)，但對(duì)三甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲嗯唑天然敏感。目前尚無標(biāo)準(zhǔn)方法用于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的耐藥性檢測(cè)，可用肉湯或瓊脂稀釋法及E-test法檢測(cè)其抗生素敏感性。產(chǎn)堿桿菌屬產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)在伯杰系統(tǒng)細(xì)菌手冊(cè)中被分為2個(gè)種：糞產(chǎn)堿桿菌(A.faecalis)和木糖氧化產(chǎn)堿桿菌(A.xylosoxidans)；后者又分為2個(gè)亞種：木糖氧化產(chǎn)堿桿菌木糖氧化亞種(A.xylosoxidanssubsp.xylosoxidans)和木糖氧化產(chǎn)堿桿菌脫硝亞種(A.xylosoxidanssubsp.denitrificans)。有醫(yī)學(xué)意義的產(chǎn)堿桿菌除上述三種菌外，尚有皮氏產(chǎn)堿桿菌(A.piechaudii)，典型菌種是糞產(chǎn)堿桿菌。1.細(xì)菌特性革蘭陰性短桿菌，常成單、雙或成鏈狀排列，具有周鞭毛，無芽胞，多數(shù)菌株無莢膜。專性需氧，最適生長(zhǎng)溫度25°C?37°C，部分菌株42°C能生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求不高，普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，麥康凱和SS平板亦可生長(zhǎng)。氧化酶陽性，不分解任何糖類，葡萄糖OF培養(yǎng)基中產(chǎn)堿，本屬細(xì)菌除能利用檸檬酸鹽和部分菌株能還原硝酸鹽外，多數(shù)生化反應(yīng)為陰性。臨床意義本屬中臨床分離最常見的是糞產(chǎn)堿桿菌，大部分感染是條件致病，主要來自潮濕環(huán)境，如霧化器、呼吸機(jī)和灌洗液等，血、痰、尿、腦脊液等是常見的發(fā)現(xiàn)部位，是醫(yī)院感染的病原菌之一。微生物學(xué)檢驗(yàn)檢驗(yàn)程序與不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌檢驗(yàn)程序相同。標(biāo)本采集根據(jù)臨床疾病不同采集不同標(biāo)本，如血、尿、痰、膿汁、腦脊液等。檢驗(yàn)方法顯微鏡檢查腦脊液、尿液離心取沉淀涂片，膿汁和痰液可直接涂片革蘭染色鏡檢，本菌為革蘭陰性短桿菌，有周鞭毛。分離培養(yǎng)血液、腦脊液標(biāo)本需肉湯增菌后再轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基，膿汁、分泌物、尿液可直接接種血平板和麥康凱平板。經(jīng)18h?24h培養(yǎng)后，在血平板上可形成大小不等、灰白色、扁平、邊緣稍薄的的濕潤(rùn)菌落，糞產(chǎn)堿桿菌部分菌株有水果香味；在麥康凱和SS平板上形成無色透明菌落；在液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁生長(zhǎng)，表面形成菌膜，管底有粘性沉淀。鑒定與鑒別本屬細(xì)菌與產(chǎn)堿假單胞菌極為相似，二者主要區(qū)別在于前者為周毛菌而后者為極端單鞭毛菌；在含有蛋白胨的肉湯培養(yǎng)基中產(chǎn)氨，使pH上升至8.6,為本菌的鑒別特征。木糖氧化產(chǎn)堿桿菌木糖氧化亞種通過使OF葡萄糖和OF木糖產(chǎn)酸而很容易和其他產(chǎn)堿桿菌區(qū)別；糞產(chǎn)堿桿菌在碳水化合物培養(yǎng)基上呈強(qiáng)烈的產(chǎn)堿反應(yīng)，大部分菌株形成細(xì)小、邊緣不規(guī)則的菌落，某些菌株產(chǎn)生特征性的水果味并使血平板呈綠色，本菌的一個(gè)重要生化特征是能還原亞硝酸鹽而不能還原硝酸鹽。皮氏產(chǎn)堿桿菌通過能還原硝酸鹽和能在6.5%NaCl中生長(zhǎng)可與其他產(chǎn)堿桿菌區(qū)別；木糖氧化產(chǎn)堿桿菌脫硝亞種較少從臨床分離到。（4）耐藥性藥物敏感試驗(yàn)的藥物選擇與假單胞菌相同，臨床治療可以用哌拉西林及替卡西布克拉維酸，其他根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選藥。（十）軍團(tuán)菌屬伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)將其定為軍團(tuán)菌科，軍團(tuán)菌屬。該菌屬較為復(fù)雜，時(shí)有新種發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已命名的菌種分別來自人體和環(huán)境，共有39種及3個(gè)亞種，64個(gè)血清型。模式菌是嗜肺軍團(tuán)菌。1.細(xì)菌特性（1）形態(tài)染色革蘭陰性桿菌，無芽胞，無莢膜，有端鞭毛或側(cè)鞭毛，動(dòng)力陽性。（2）培養(yǎng)特性能在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，專性需氧，同時(shí)生長(zhǎng)環(huán)境中還需2.5%?5%的二氧化碳；其生長(zhǎng)的pH范圍較窄，最適pH6.4?7.2,在pH1.7時(shí)則死亡;最適生長(zhǎng)溫度35°C，可生長(zhǎng)的溫度范圍為25°C?42°C，在外環(huán)境中甚至水溫達(dá)63C時(shí)亦可分離到本菌；營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，普通培養(yǎng)基、血平板和巧克力平板均不生長(zhǎng)，生長(zhǎng)過程中需要多種微量元素作為酶的協(xié)同因子或在代謝中起重要作用，同時(shí)需要氨基酸，以甲硫氨酸和半胱氨酸最為重要。生長(zhǎng)緩慢，固體培養(yǎng)基在培養(yǎng)48h左右，在濃密涂種處可見生長(zhǎng)。不同培養(yǎng)基上菌落的形成和表現(xiàn)不同，目前公認(rèn)的最適宜培養(yǎng)基是緩沖活性炭酵母浸出液，加上鐵、L-半胱氨酸和a-酮戊二酸（在不含L-半胱氨酸的BCYE和血平板上不生長(zhǎng)），稱之為BCYEa（bufferedcharcoal-yeastextractagar）培養(yǎng)基。（3）生化反應(yīng)生化反應(yīng)可作為鑒定時(shí)的參考，大多數(shù)菌種能產(chǎn)生p內(nèi)酰胺酶和液化明膠、水解淀粉，觸酶陽性，氧化酶弱陽性；硝酸鹽還原、尿素酶和碳水化合物利用反應(yīng)都是陰性；所有嗜肺軍團(tuán)菌血清型（血清型4和15除外）的各個(gè)菌株均具有極強(qiáng)的水解馬尿酸鹽的作用，而其他軍團(tuán)菌則陰性。（4）抵抗力軍團(tuán)菌已成為天然水環(huán)境中常在的一大類菌群，嗜肺軍團(tuán)菌的生存能力較強(qiáng)，在含有藻類物質(zhì)的氣溶膠中可長(zhǎng)期存活，對(duì)紫外線敏感，對(duì)熱和常用的化學(xué)消毒劑敏感。臨床意義軍團(tuán)病在世界各地均有發(fā)病，但主要在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家流行，國(guó)內(nèi)多屬散發(fā)報(bào)道。本菌廣泛存在于土壤及自然和人工的水環(huán)境中，尤其是在空調(diào)冷凝水中的檢出率最高。大多數(shù)病例（85%）是嗜肺軍團(tuán)菌引起的，其中嗜肺軍團(tuán)菌1血清型和6血清型占75%。高發(fā)于夏秋季，細(xì)菌通過空氣傳播，易侵犯患有慢性器質(zhì)性疾病或免疫功能低下的患者，最常見的是肺炎型。微生物學(xué)檢驗(yàn)（1）檢驗(yàn)程序見圖11-4。血液、胸水痰、組織、（無菌手續(xù)制成懸液）血清間接熒光抗體染色ELISAI檢測(cè)抗體增菌?BCYE血平板巧克力35°C2.5%血液、胸水痰、組織、（無菌手續(xù)制成懸液）血清間接熒光抗體染色ELISAI檢測(cè)抗體增菌?BCYE血平板巧克力35°C2.5%CO2平板需Q涂片革蘭直接熒光抗體檢測(cè)

染色抗原、核酸檢測(cè)生長(zhǎng)48h后生長(zhǎng)，24h生長(zhǎng)，可疑菌落非軍團(tuán)菌涂片革蘭染色革蘭陽性菌非軍團(tuán)菌革蘭陰性桿菌（2）標(biāo)本采集標(biāo)本應(yīng)小心收集避免氣溶膠的形成，最好于收集后兩小時(shí)內(nèi)用無菌防漏容器在環(huán)境溫度下小心送到實(shí)驗(yàn)室。1）適用的標(biāo)本主要包括咳出的痰、用支氣管鏡收集的材料、經(jīng)氣管吸出物、胸腔積液和血液等。除胸水和血液外，其他標(biāo)本中均混有正常菌群及其他病原菌，正常菌群對(duì)軍團(tuán)菌有殺滅作用，取材后應(yīng)及時(shí)分離培養(yǎng)，并使用加抗生素的選擇培養(yǎng)基。2）病理組織標(biāo)本如閉合或開放的肺活檢材料、尸體標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝、脾等標(biāo)本必須制成懸液，再進(jìn)行涂片和分離培養(yǎng)。3）環(huán)境污染標(biāo)本如水、土壤等，水標(biāo)本應(yīng)先濃縮再接種，土壤標(biāo)本加入水中振蕩30min取水樣，參照水標(biāo)本處理。（3）檢驗(yàn)方法1）顯微鏡檢查標(biāo)本直接涂片革蘭染色，意義不大。2）分離培養(yǎng)本菌營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，生長(zhǎng)緩慢，在35C?37C，相對(duì)濕度70%?80%，2.5%?5.0%CO2環(huán)境下，BCYE培養(yǎng)基上培養(yǎng)2?5d可形成直徑1?2mm有光澤的菌落，在F-G（Feeley-Garman）瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3?5d可見針尖大小的菌落，在紫外線照射下可產(chǎn)生熒光。標(biāo)本如在血平板、巧克力平板上生長(zhǎng)或在BCYE或F-G平板上24h生長(zhǎng)，則不是軍團(tuán)菌。臨床標(biāo)本如有污染，可在培養(yǎng)基中加入對(duì)軍團(tuán)菌無抑制作用的抗生素如頭抱噻吩4pg/ml、多粘菌素E16U/ml、萬古霉素0.5pg/ml、放線菌酮80pg/ml。3）鑒定在血平板、巧克力平板及不含L半胱氨酸的BCYE平板上不生長(zhǎng)，而在含有L半胱氨酸的BCYE和F-G培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢、形成典型菌落；革蘭陰性小桿菌，有顯著的多形性，均應(yīng)懷疑為軍團(tuán)菌。對(duì)可疑菌株可作直接熒光抗體染色等血清學(xué)鑒定和生化反應(yīng)，必要時(shí)作細(xì)菌脂肪酸的氣液相色譜分析和DNA雜交、PCR試驗(yàn)。4）免疫學(xué)檢測(cè)檢測(cè)軍團(tuán)菌血清抗體的方法主要有間接免疫熒光染色（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）及放射免疫測(cè)定等，其中以IFA在臨床應(yīng)用最多。急性期和恢復(fù)期雙份血清抗體效價(jià)增加4倍以上并達(dá)31:128或單份血清抗體效價(jià)達(dá)到或超過1:256為陽性。本法取恢復(fù)期血清需時(shí)較久（1?3個(gè)月），且可能與其他細(xì)菌的抗體起交叉反應(yīng)。5）核酸檢測(cè)是快速特異方法，常用DNA探針和PCR方法檢測(cè)軍團(tuán)菌rRNA，可用于軍團(tuán)菌的快速診斷。（4）耐藥性軍團(tuán)菌體外抗生素敏感性試驗(yàn)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且與臨床治療反應(yīng)不一致，因此，并不主張對(duì)醫(yī)院診斷實(shí)驗(yàn)室分離的軍團(tuán)菌進(jìn)行體外抗生素敏感性試驗(yàn)。目前已取得明顯臨床效果的抗菌藥物主要是大環(huán)內(nèi)酯類藥物、利福平、氟喹諾酮類藥物，其次是四環(huán)素類。青霉素、頭抱菌素、氨基糖苷類抗生素治療本菌無效。（十一）其他非發(fā)酵革蘭陰性桿1.黃桿菌科（1）細(xì)菌特性本科細(xì)菌是一群無動(dòng)力、無芽胞、氧化酶陽性的革蘭陰性桿菌。觸酶陽性，臨床可分離到的菌株一般均可產(chǎn)生吲哚；腦膜敗血金色桿菌DNA酶陽性，動(dòng)物傷口伯杰菌脲酶強(qiáng)陽性。專性需氧，最適生長(zhǎng)溫度35r，營(yíng)養(yǎng)要求不高，普通培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，臨床可分離到的菌株（除動(dòng)物傷口伯杰菌外）均可產(chǎn)生不溶性的黃色色素，在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較弱或完全不生長(zhǎng)，粘液威克菌可形成黏液樣黏性菌落，難以從瓊脂上分離。（2）臨床意義本科細(xì)菌在醫(yī)院主要存在于有水的環(huán)境和潮濕的物體表面，對(duì)人致病的有腦膜敗血金色桿菌、產(chǎn)吲哚金色桿菌、短穩(wěn)桿菌、粘液威克菌、動(dòng)物傷口伯杰菌等，其中腦膜敗血金色桿菌是使人類致病的最常見的菌種，對(duì)早產(chǎn)兒具有高度致病性，可致新生兒腦炎，在嬰兒室引起流行，且死亡率較高，也可引起免疫力低下成人肺炎。（3）微生物學(xué)檢驗(yàn)1）分離培養(yǎng)與鑒定經(jīng)35°C、18~24h培養(yǎng)后，在普通培養(yǎng)基上可形成光滑、有光澤、邊緣整齊、直徑1?1.5mm的菌落，典型菌落為淡黃色，也有的呈黃色或棕黃色。生化鑒定是黃桿菌科細(xì)菌鑒別的主要指標(biāo)，詳見表11-3。2）耐藥性臨床常見的腦膜敗血金色桿菌對(duì)廣譜抗菌藥物如氨基糖苷類、0-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素等有耐藥性，治療最好根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇藥物。臨床經(jīng)驗(yàn)用藥可選用