【教學(xué)】第7章-第6節(jié)-生物芯片技術(shù)(3-LMJ)

江黎明2012年10月生物芯片技術(shù)第十四章BiochipTechnology《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》藥立波主編編輯ppt第一節(jié)概述一、生物芯片的概念二、DNA芯片一、基因表達(dá)譜研究一、原位合成DNA芯片制作二、DNA微陣列芯片制作一、待測(cè)樣品的準(zhǔn)備二、分子雜交反應(yīng)三、檢測(cè)分析第二節(jié)生物芯片的制作第三節(jié)DNA芯片使用的基本流程第四節(jié)蛋白質(zhì)芯片第五節(jié)生物芯片的基本操作和流程二、DNA測(cè)序三、基因突變檢測(cè)四、基因診斷五、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用六、藥物研發(fā)目錄2023/4/152編輯ppt生物芯片(biochip)技術(shù)是20世紀(jì)90年代初期由分子生物學(xué)、微電子學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科交叉融合而發(fā)展起來(lái)的高新技術(shù)，因既具有重大的學(xué)術(shù)價(jià)值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景，被評(píng)為1998年度世界十大科技進(jìn)展之一。

生物芯片是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義的科學(xué)技術(shù)革命。

生物芯片將會(huì)改變生命科學(xué)的研究方式，革新醫(yī)學(xué)診斷和治療，極大地提高人口素質(zhì)和健康水平。第一節(jié)概述

編輯ppt編輯ppt薩瑟恩提出的核酸雜交理論，即標(biāo)記的核酸分子能夠與被固化的與之互補(bǔ)配對(duì)的核酸分子雜交。（EdwinMellorSouthern）Southern雜交可以被看作是生物芯片的雛形。2023/4/155編輯ppt桑格和吉爾伯特發(fā)明了現(xiàn)在廣泛使用的DNA測(cè)序方法，并由此在1980年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。（FrederickSanger）（WalterGilbert）生物芯片這個(gè)概念首先是由FredSanger和WalterGilbert提出的；解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、低通量等不足。2023/4/156編輯ppt

1989，Stephen

Fodor(斯蒂文·弗爾多)發(fā)明了高密度生物芯片和芯片閱讀器，為生物芯片產(chǎn)業(yè)開(kāi)創(chuàng)及發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。1992，Affymatrix公司Fodor小組運(yùn)用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，對(duì)原位合成制備的DNA芯片作了首次報(bào)道，這是世界上第一塊基因芯片。2023/4/157編輯ppt1995，Stanford大學(xué)的P.Brown實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了第一塊以玻璃為載體的基因微矩陣芯片；將cDNA密集點(diǎn)樣在玻璃片上，進(jìn)行基因表達(dá)譜研究和SNP分析。2023/4/158編輯ppt一、生物芯片的概念指通過(guò)微電子和微加工技術(shù)，將大量已知序列的核酸或蛋白片段等，有序地組合在1CM2大小固相介質(zhì)表面而構(gòu)成的集成分析系統(tǒng)。可與標(biāo)記的核酸或蛋白分子特異結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸、蛋白等生物組分的快速、高效、敏感的處理與分析。狹義的生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片等。廣義的生物芯片還包括用于研制生物計(jì)算機(jī)的生物芯片、將健康細(xì)胞與電子集成電路結(jié)合起來(lái)的仿生芯片、縮微化的實(shí)驗(yàn)室即芯片實(shí)驗(yàn)室。2023/4/159編輯ppt生物芯片的基本原理與特征：“芯片”特征：“分子雜交”原理：生物分子間的相互特異識(shí)別作用（如:DNA分子之間、蛋白分子之間、DNA與蛋白分子之間以及自組裝單分子膜之間等）高通量、高集成、并行化、微型化、自動(dòng)化、連續(xù)化2023/4/1510編輯ppt根據(jù)芯片的用途可分為兩大類2023/4/1511編輯ppt二、DNA芯片又被稱為基因芯片(genechips)、DNA陣列(DNAarray)、cDNA芯片(cDNAchips)、寡核苷酸陣列(oligonucleotidearray)等。

DNA芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先合成的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面；使用時(shí)與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析從而得出樣品的遺傳信息。2023/4/1512編輯ppt

1.玻片型這種芯片的點(diǎn)陣是通過(guò)原位合成技術(shù)制作的，點(diǎn)陣密度很高，所以必須借助于特殊的儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行解讀和分析。有此類產(chǎn)品研制能力的公司不多,如Affimetrix公司。（一）從支持物來(lái)分主要有：2023/4/1513編輯ppt

2.薄膜型如聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等。這種類型“芯片”的點(diǎn)陣是通過(guò)“點(diǎn)膜”形式制作的，并通過(guò)一定的方法使探針能夠牢固地結(jié)合于其上，整個(gè)過(guò)程類似于斑點(diǎn)雜交技術(shù)（如CloneTech公司）。2023/4/1514編輯ppt3.微板型這種芯片實(shí)質(zhì)上是一種具有高密度、小容量測(cè)試孔的小型酶聯(lián)免疫檢測(cè)板（如PE公司等）。2023/4/1515編輯ppt4.集成電路型將雜交技術(shù)與微電子技術(shù)結(jié)合于一體，通過(guò)電子裝置檢測(cè)或控制DNA等生物大分子的作用過(guò)程（如Nanogen公司）2023/4/1516編輯ppt原位合成芯片DNA微陣列研發(fā)小組Affymatrix公司Fodor研究組斯坦福大學(xué)Brown實(shí)驗(yàn)室制作方式原位化學(xué)合成收集探針，顯微打印探針類型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA等探針長(zhǎng)度短，小于50nt較長(zhǎng)，100~500nt或更長(zhǎng)最高集成度10~40萬(wàn)點(diǎn)陣/cm21~10萬(wàn)點(diǎn)陣/cm2專利保護(hù)專利控制嚴(yán)格無(wú)專利控制（二）根據(jù)制作方式可分為兩大類：原位合成芯片(syntheticgenechip)DNA微集陣列(DNAmicroarray）2023/4/1517編輯ppt基因芯片的制作方式原位合成直接點(diǎn)樣顯微光蝕刻技術(shù)(光引導(dǎo)原位合成)分子印章法分子印章法針式點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣壓電打印法第二節(jié)生物芯片的制作2023/4/1518編輯ppt一、原位合成DNA芯片的制作(一)顯微光蝕刻技術(shù)支持物經(jīng)化學(xué)處理,

表面活性羥基(OH)連接光敏保護(hù)基(X),選用光刻掩模(M1)保護(hù)非聚合部位；2.用激光點(diǎn)光源照射聚合部位,去除光敏保護(hù)基(X),暴露活性羥基(OH)；

3.加入單核苷酸(如dTMP)的亞磷酰胺活化端與活性羥基(OH)發(fā)生化學(xué)偶聯(lián),光敏保護(hù)非活化端；4.更換掩模(M2)，激光點(diǎn)光源照射下一個(gè)位點(diǎn)；5.脫保護(hù)，偶聯(lián)第二個(gè)核苷酸(如dCMP)；6.重復(fù)上述步驟，直至合成完所需探針。2023/4/1519編輯ppt合成過(guò)程光刻掩模1光刻掩模2編輯ppt(一)探針的設(shè)計(jì)與制備

DNA微集陣列探針可用人工合成寡核苷酸、基因組DNA或cDNA中的目的基因片段；可為雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA，亦可用肽核酸(PNA)等。二.DNA微集陣列芯片的制作肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)——是一類以氨基酸替代糖-磷酸主鏈的DNA類似物，骨架由重復(fù)的N-甘氨酸通過(guò)酰胺鍵相連構(gòu)成，堿基則通過(guò)甲叉碳?；c骨架相連。PNA分子內(nèi)不會(huì)形成二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)；DNA與PNA雜交不需要鹽離子。2023/4/1521編輯ppt探針制備：常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)(如基因克隆、PCR、RT-PCR、化學(xué)合成等)。探針的純化：探針的選擇：cDNA探針用于基因表達(dá)譜分析；寡核苷酸探針用于基因突變檢測(cè)。陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照空白對(duì)照脫鹽、除酶及去除過(guò)剩的DNA等。DNA芯片探針實(shí)驗(yàn)組探針對(duì)照組探針2023/4/1522編輯ppt固相支持物分為實(shí)性材料和膜性材料兩類：最常用的玻片預(yù)處理方法：實(shí)性材料有硅芯片、玻片和瓷片等；膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜和硝酸纖維膜。(二)支持物的類型與預(yù)處理采用多聚賴氨酸包被，氨基硅烷化，醛基化等方法，使其表面衍生出氨基或醛基。2023/4/1523編輯ppt1.噴墨打印將合成用探針溶液放入打印墨盒內(nèi)，由電腦依據(jù)預(yù)定的程序在xyz方向自動(dòng)控制打印噴頭在芯片支持物上移動(dòng)，并將特定的探針試劑噴印到特定位點(diǎn)。

噴印上去的試劑即以固相合成原理與該處支持物發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。(三)探針的打印2023/4/1524編輯ppt1)玻璃片基的處理：使玻璃表面獲得羥基、醛基、氨基等活性基團(tuán)；優(yōu)點(diǎn)：成本低，操作簡(jiǎn)單，密度高(幾十萬(wàn)點(diǎn)cm2)，

轉(zhuǎn)移過(guò)程中探針溶液損失小。2.針式打印缺點(diǎn)：定量準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性不好。2)點(diǎn)樣針沾取探針溶液；3)點(diǎn)樣針把探針點(diǎn)到玻片表面，讓探針末端的化學(xué)集團(tuán)與玻片表面的集團(tuán)形成共價(jià)鍵。2023/4/1525編輯ppt2202芯片點(diǎn)樣儀

生產(chǎn)商：Bio-Rad；性能介紹：分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(Z軸)。

重復(fù)性：3um；球面精確性：l0um。一次制成芯片數(shù)：126塊芯片，每塊玻片點(diǎn)樣量>82,000個(gè)點(diǎn)。2023/4/1526編輯ppt

氨基修飾的玻片，可以一定能量的紫外線進(jìn)行照射，使DNA探針中的胸腺嘧啶殘基，與支持物上帶正電的氨基形成共價(jià)鍵而固定在玻片表面；

醛基修飾的玻片，可使氨基末端修飾探針的氨基，與玻片上的醛基形成Schiff堿，使DNA探針固定在玻片表面。(四)探針的固化2023/4/1527編輯ppt

一、待測(cè)樣品的制備用PCR或反轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記時(shí)，可用熒光標(biāo)記底物(dNTP)，

也可標(biāo)記引物的5’末端。第三節(jié)DNA芯片使用的基本流程雙色熒光標(biāo)記：待測(cè)樣品用Cy3；對(duì)照用Cy5。常用于標(biāo)記的熒光分子有：Cy3、Cy5、FITC、TRITC

和生物素等。組織細(xì)胞或其他材料提取核酸純化純核酸核酸純化隨機(jī)引物延伸、PCR或反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記2023/4/1528編輯ppt類型：固-液相雜交(固相：探針；液相：靶核酸)。特點(diǎn)：探針的數(shù)量>>

靶基因的數(shù)量反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：呈線性關(guān)系信號(hào)強(qiáng)度∝

(樣品)靶基因的量空間位阻效應(yīng)：探針—靶分子；探針—探針2.雜交反應(yīng)條件優(yōu)化PNA分子內(nèi)無(wú)帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)。1.芯片雜交的特點(diǎn)：3.Nnogen公司研制出的電子基因芯片。二、分子雜交反應(yīng)2023/4/1529編輯ppt檢測(cè)芯片熒光信號(hào)有兩類儀器：1、利用電荷偶合裝置檢測(cè)的攝像儀；2、激光共聚焦掃描儀。所謂激光共聚焦，是指激發(fā)光路和發(fā)射光路分別在兩個(gè)位置上聚焦。應(yīng)注意如何有效防止來(lái)自雜質(zhì)的熒光信號(hào)，提高信/噪比。三、檢測(cè)分析2023/4/1530編輯ppt(入射)激光束發(fā)射光濾鏡檢測(cè)透鏡檢測(cè)器共聚焦針孔熒光束光束分離器(分光鏡)物鏡支持物由樣品發(fā)射的熒光圖14-4共聚焦掃描示意圖反光鏡樣品放大器數(shù)模轉(zhuǎn)換器計(jì)算機(jī)2023/4/1531編輯ppt2023/4/1532編輯ppt基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)主要包括四個(gè)主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè)以及結(jié)果分析(圖13-4)。

基因芯片技術(shù)主要步驟2023/4/1533編輯ppt將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，加入待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)?；驹恚旱鞍踪|(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構(gòu)象上能特異性的相互識(shí)別和相互結(jié)合?！址Q蛋白質(zhì)陣列(proteinarray)第四節(jié)蛋白質(zhì)芯片最常用的探針：抗體檢測(cè)方法：標(biāo)記檢測(cè)法、直接檢測(cè)法2023/4/1534編輯ppt4.不同的McAb可通過(guò)機(jī)械點(diǎn)涂方式固定在膜性載

體表面.一、芯片的制作1.作為探針的多肽(或蛋白質(zhì))，可原位合成，也可

先合成后固化。2.蛋白質(zhì)芯片的載體常選擇膜性材料，如尼龍膜、NC膜、聚偏氟乙烯膜等。3.蛋白質(zhì)芯片的載體的處理方法與核酸芯片載體

相似。2023/4/1535編輯ppt1.待檢測(cè)樣品抗原從體液、組織細(xì)胞,或從cDNA表達(dá)文庫(kù)中提取多肽和蛋白質(zhì)。2.若作蛋白質(zhì)組學(xué)研究，應(yīng)同時(shí)制備正常與病變組

織的蛋白質(zhì)樣品。3.蛋白質(zhì)樣品的標(biāo)記：采用熒光素(Cy3、Cy5)、放

射性同位素等，也可用酶標(biāo)法標(biāo)記。二、樣品的制備2023/4/1536編輯ppt1.標(biāo)記的多肽樣品與探針之間的反應(yīng)有：用激光掃描儀、磷光成像儀、質(zhì)譜儀、酶標(biāo)儀等檢測(cè)后,再用相應(yīng)的軟件對(duì)獲得的信號(hào)分析。三、生化反應(yīng)Ag+AbH+R[Ag-Ab][H-R]2.反應(yīng)結(jié)束后即行洗脫。等等。四、檢測(cè)分析2023/4/1537編輯ppt第五節(jié)生物芯片在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用一、基因差異表達(dá)譜分析二、DNA測(cè)序三、基因突變的檢測(cè)四、基因診斷五、藥物研究開(kāi)發(fā)六、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用2023/4/1538編輯ppt一、DNA芯片與基因差異表達(dá)譜分析(一)探針的設(shè)計(jì)與芯片的制作(二)待測(cè)樣品核酸的提取、擴(kuò)增與標(biāo)記(三)雜交反應(yīng)與雜交后清洗(四)掃描與分析(五)結(jié)果與討論2023/4/1539編輯ppt

cDNA2023/4/1540編輯ppt(一)探針的設(shè)計(jì)與芯片的制作1.探針的設(shè)計(jì)--寡核苷酸探針設(shè)計(jì)原則(1)完全互補(bǔ)性：對(duì)目的基因或相關(guān)序列的保守區(qū)而言，PM

探針。(3)探針的豐度：針對(duì)靶基因序列設(shè)計(jì)多個(gè)(3個(gè)以上)寡核苷

酸探針。(2)高度特異性：對(duì)基因家族的某個(gè)成員或?qū)Σ煌锓N屬

的同一基因而言。(4)單堿基錯(cuò)配：即設(shè)計(jì)MM(mis-match)探針：作內(nèi)參照(衡

量探針的特異性)。(5)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照：采用看家基因β-actin或GADPH基因作為陽(yáng)性對(duì)照。2023/4/1541編輯ppt離心2.探針的制備(細(xì)菌培養(yǎng)平板)cDNA文庫(kù)

挑取

cDNA克隆

擴(kuò)增培養(yǎng)(液體培養(yǎng))PCR擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物電泳(鑒定含靶序列的克隆)相應(yīng)的

PCR產(chǎn)物+

異丙醇打印加DMSO溶解

揮干乙醇70％乙醇洗滌取沉淀2023/4/1542編輯ppt(1)玻片的清洗4.探針的打印與固化3.玻片的多聚-L-賴氨酸預(yù)處理(1)編輯打印程序、探針打印(2)紫外線照射(使探針與玻片交聯(lián)結(jié)合)(3)80℃烘干固定、室溫避光保存(2)用多聚-L-賴氨酸處理玻片NaOH乙醇浸泡振蕩至少2hr；雙蒸水反復(fù)漂洗。多聚-L-賴氨酸溶液浸泡振蕩15min~1hr；雙蒸水反復(fù)漂洗；離心、45℃干燥。2023/4/1543編輯ppt反轉(zhuǎn)錄熒光標(biāo)記：組織或細(xì)胞抽提總RNA分離

mRNAAAA…AAA3’oligodT引物dNTP,RT-ase熒光標(biāo)記dCTP或…SS-cDNATTTTTT5’(二)待測(cè)樣品核酸的提取、擴(kuò)增與標(biāo)記(Cy3為紅色,標(biāo)記處理組；Cy5為綠色,標(biāo)記對(duì)照組)2023/4/1544編輯ppt后續(xù)步驟：1.終止反應(yīng)降解模板(總RNA或mRNA)；2.過(guò)柱濾去游離的熒光核苷酸；3.洗脫、濃縮、真空干燥獲取純化的核酸樣品；4.溶解(DEPC處理的水)成樣品液2023/4/1545編輯ppt注意事項(xiàng)：若用Cy3-dCTP或Cy5-dCTP(分別標(biāo)記2種樣品)，則應(yīng)相應(yīng)調(diào)整其余3種dNTP的濃度。對(duì)同一種dNTP，既要加入熒光標(biāo)記的，也要加入非標(biāo)記的(如Cy3-dCTP與dCTP)，并調(diào)整兩者的比例，使雜交信號(hào)最強(qiáng)。不同來(lái)源的樣品分別用不同顏色的熒光素標(biāo)記(Cy3為紅色,標(biāo)記處理組；Cy5為綠色,標(biāo)記對(duì)照組)，以便比較分析；2023/4/1546編輯ppt芯片雜交與常規(guī)分子雜交相似，但探針不標(biāo)記，而待測(cè)核酸(液相)標(biāo)記。分析過(guò)程：預(yù)雜交雜交洗滌干燥檢測(cè)(掃描與分析)影響因素：探針堿基組成及其濃度靶核酸長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度溫度雜交液的組成條件設(shè)置：高離子強(qiáng)度、高樣品濃度、長(zhǎng)時(shí)間、低溫度(雜交)(三)雜交反應(yīng)與雜交后清洗2023/4/1547編輯ppt1.圖像分析將掃描得到的Cy3/Cy5文件通過(guò)劃格，確定陽(yáng)性雜交點(diǎn)及其背景，過(guò)濾(減去)背景，得到基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(值)。通常用Cy3/Cy5熒光強(qiáng)度的比值來(lái)鑒別差異表達(dá)基因(多用平均值表示)。(四)掃描與分析2023/4/1548編輯ppt(1)標(biāo)準(zhǔn)化處理將某些看家基因Cy3/Cy5熒光強(qiáng)度平均比值調(diào)節(jié)為1。(2)比值分析一般認(rèn)為，Cy3/Cy5在0.5-2.0范圍內(nèi)不存在顯著的差異表達(dá)基因；若超出此范圍，則存在差異表達(dá)基因。2.數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理與分析2023/4/1549編輯ppt(1)cDNA探針的質(zhì)量控制PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳鑒定：應(yīng)顯示單一清晰條帶。(2)總RNA的提取與鑒定1)電泳鑒定：應(yīng)顯2條帶(18SrRNA及28SrRNA)；2)紫外吸收值測(cè)定：A260/A280均應(yīng)在1.9-2.0之間。3.結(jié)果與討論2023/4/1550編輯ppt(3)雜交結(jié)果的掃描與分析對(duì)照組(以綠色Cy5標(biāo)記)，見(jiàn)圖14-6中的(1)所示每個(gè)探針3個(gè)點(diǎn)的陽(yáng)性雜交信號(hào)均一性及3次實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性均較好?？瞻着c陰性對(duì)照均無(wú)信號(hào)或很弱,[圖(1)和圖(2)中倒1行第13-18個(gè)點(diǎn)及第7-12個(gè)點(diǎn)]圖(1)和圖(2)中倒1行第1-6個(gè)熒光點(diǎn)分別代表陽(yáng)性參照GAPDH的Cy3和Cy5信號(hào)強(qiáng)度，且Cy3/Cy5=1.0處理組(以紅色Cy3標(biāo)記)，見(jiàn)圖14-6中的(2)所示表明：探針是特異的，結(jié)果是可靠的。2023/4/1551編輯pptBiologicalSampleFunctionalInformation紅色表示上調(diào)；黃色表示不變；綠色表示下調(diào)(4)圖像重疊分析紅色Cy3標(biāo)記處理組，綠色Cy5標(biāo)記對(duì)照組2023/4/1552編輯ppt用基因芯片檢測(cè)基因表達(dá)譜的過(guò)程小結(jié)2023/4/1553編輯ppt只能對(duì)已知序列作重測(cè)序(resequencing)雜交測(cè)序(sequencingbyhybridization,SBH)是用DNA芯片上的探針與樣品核酸的靶序列進(jìn)行分子雜交，再據(jù)雜交圖譜排列出靶DNA的堿基順序。舉例：二、DNA測(cè)序DNA芯片上原位合成8mer探針

{具48(65536)個(gè)點(diǎn)陣}12nt的靶序列雜交雜交圖譜2023/4/1554編輯ppt（一）探針設(shè)計(jì)的疊瓦式策略(tilingstrategy)以突變區(qū)每個(gè)堿基為中心依次向左、右兩邊延伸，選取一定長(zhǎng)度(15-25個(gè)堿基)的靶序列，合成與其互補(bǔ)的寡核苷酸片段作為野生型探針；然后將中央位點(diǎn)的堿基分別替換成其它三種堿基，得到3個(gè)突變型的探針。三、基因突變的檢測(cè)每組探針之間像疊瓦片一樣錯(cuò)開(kāi)一個(gè)堿基；N個(gè)堿基長(zhǎng)度的突變區(qū)就需要N組探針，每組含1個(gè)野生型和3個(gè)突變型的探針；共獲4N個(gè)探針。然后以下一個(gè)位為中心，設(shè)計(jì)另一組探針。2023/4/1555編輯ppt靶分子…GCAAACGAGTCAAAAGTCC野生型探針AC突變型探針GT以下一個(gè)位點(diǎn)為中A心設(shè)計(jì)另一組探針： C

GT對(duì)稱中心......................................................................................................................N組探針；4N個(gè)探針2023/4/1556編輯ppt寡核苷酸探針設(shè)計(jì)、合成，在其末端加上10~15個(gè)堿基的polyT作為連接分子臂，分子臂末端進(jìn)行氨基修飾，如加上氨基臂PO4(CH2)6NH2。玻片通常先采用氨基硅烷(3-氨丙基三甲氧基硅