第二章基因工程的工具酶

第二章基因工程的工具酶第1頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一1.工具酶的概念應(yīng)用與基因工程的各種酶的總稱.大量應(yīng)用的是核酸酶.切:限制性內(nèi)切酶連:

DNA連接酶修飾酶，聚合酶第2頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一/listplay/sJj53SXK_PQ/-TXTvgODA4I.html/listplay/sJj53SXK_PQ/u-6RLhVXzv0.html?FR=LIAN第3頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一幾乎所有細(xì)菌均可產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶。1962年，瑞士的W.Arber提出限制與修飾假說。限制性內(nèi)切酶：識別特定序列DNA甲基化酶：甲基化該特定序列，保護(hù)細(xì)菌DNA第4頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一2.限制性內(nèi)切酶I型：隨機切割，核酸內(nèi)切酶，甲基化酶，ATP酶，DNA解旋酶II型：僅識別特定DNA序列，廣泛應(yīng)用III型：具有限制和修飾雙重作用，應(yīng)用較少第5頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一限制性內(nèi)切酶的命名基本名稱具該酶的機體屬名的第一個字母（大寫）種名的前兩個字母（小寫）大腸桿菌Escherichiacoli流感嗜血菌Haemophilus

influenzae短桿菌Brevibacteriumalbidum粘質(zhì)沙雷式菌Serratiamarcescens第6頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一同一菌種具有不同的菌株或菌型基本名稱

菌株或菌型(小寫)大腸桿菌k型菌株Ecok流感嗜血菌d型菌株Hind限制酶由染色體外的成分，如病毒、質(zhì)粒等引起基本名稱質(zhì)粒、病毒的輔助字母EcoR第7頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一某一菌株具有多個不同的限制酶體系，用羅馬字母表示發(fā)現(xiàn)的先后順序Hind

II:EcoR

I:第8頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一有的限制酶前冠以系統(tǒng)名R

：限制性核酸內(nèi)切酶，常省略M：甲基化酶R.Hind

IIIM.Hind

III第9頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一限制酶的識別位點II型限制酶的識別系統(tǒng)識別4~6個堿基對，一般富含GC；少數(shù)識別6個以上的堿基對，為稀有酶識別序列具有回文結(jié)構(gòu)識別序列嚴(yán)格，少數(shù)僅識別一二位專一第10頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一限制酶剪切方式產(chǎn)生5’突出的黏性末端產(chǎn)生5’突出的黏性末端產(chǎn)生平齊末端第11頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一II型限制酶的反應(yīng)條件U-一個單位的限制性內(nèi)切酶合適的溫度和緩沖液，20ul體系，1h降解1ugDNA所需酶量注意酶的稀釋與保存第12頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一影響限制酶活性的因素DNA純度DNA甲基化程度酶切反應(yīng)的溫度DNA的分子結(jié)構(gòu)緩沖液第13頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一3.DNA連接酶連接酶的作用是：將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。在DNA復(fù)制、修復(fù)及體內(nèi)外重組過程中起著重要作用。第14頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一連接機理一條DNA鏈上的3’游離羥基與另一條DNA鏈上的5’末端磷酸基團(tuán)形成3’,5’-磷酸二脂鍵。第15頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一DNA連接酶的種類(1).T4噬菌體DNA連接酶不受dNTP的抑制，催化DNA片斷的連接。(2).E.coliDNA連接酶不能連接平端DNA,不能連接RNA。第16頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一T4噬菌體DNA連接酶廣泛應(yīng)用，可以連接：兩個帶有互補黏性末端的雙鏈DNA分子兩個帶有平頭末端的雙鏈DNA分子一條鏈帶有切口的雙鏈DNA分子RNA-DNA雜合體中RNA鏈切口，RNA末端與DNA連接第17頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一DNA連接酶反應(yīng)體系12~30℃下反應(yīng)1~16h。黏性末端：12~16℃，保證退火、酶活性、反應(yīng)速率間的平衡平頭末端：10~20℃，10~100倍酶量終止反應(yīng)：EDTA或75℃水浴第18頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一影響連接反應(yīng)的因素DNA末端的結(jié)構(gòu)DNA片段濃度相對分子量反應(yīng)溫度離子濃度第19頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一4.DNA聚合酶催化合成DNA的反應(yīng)的酶第20頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一DNA聚合酶分類依賴DNA的聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶T4

DNA聚合酶T7

DNA聚合酶Taq

DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶第21頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一依賴DNA的DNA聚合酶(1)大腸桿菌DNA聚合酶I（E.coliDNApolI)：具有三種酶活性a、5’---3’DNA聚合酶活性CCGATA-OHE.coliDNApolICCGATAGCCTGGCTATCGGAMg2+dNTP

GGCTATCGGAb、3’---5’外切酶活性-校正作用CGCATCG-OHE.coliDNApolICGCATCGGCGMg2+dNTPGCGc、5’---3’外切酶活性CGCATTAGE.coliDNApolICATTAGGCGTAATCMg2+GCGTAATC第22頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一大腸桿菌DNA聚合酶I制備雜交探針。Mg2+，低濃度DNA聚合酶I，同位素標(biāo)記的核苷酸處理雙鏈DNA產(chǎn)生單鏈DNADNA聚合酶I5’—3’外切酶活性和聚合酶活性同時發(fā)生，產(chǎn)生切口平移，形成帶標(biāo)記的DNA分子第23頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一(2).Klenow酶：也稱DNA聚合酶I大片段，只是從DNA聚合酶I全酶中去除了5’--3’外切酶活性Klenow酶的基本用途：a.補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端b.DNA片段的同位素末端標(biāo)記c.cDNA第二鏈的合成d.雙脫氧末端終止法測定DNA序列第24頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一(3)TaqDNA聚合酶：耐熱的DNA聚合酶PCR反應(yīng)擴增所需酶具5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性（4）逆轉(zhuǎn)錄酶體外mRNA為模板合成互補的DNA第25頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一5.堿性磷酸酶去除DNA或者RNA的5‘’磷酸，可防止自身環(huán)化。

5’pDNA5’OHDNA5’pRNA5’OHRNA第26頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一6.末端轉(zhuǎn)移酶分子量60000D,在二價陽離子的作用下，催化dNTP加于DNA分子的3’羥基端。底物：帶3’羥基端單鏈DNA或帶3’羥基突出端的雙鏈DNA。第27頁，共28頁，2023年，2月20日，星期一7.核酸酶S1S1核酸酶的基本特性：來自稻谷曲霉菌（A