基因工程藥物-概念性問題課件

基因工程藥物概念性問題基因工程概念性問題1、基因和基因組的概念2、基因工程中常用的工具酶3、基因工程克隆載體4、基因治療與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1、基因和基因組基因：基因是染色體上呈直線按順序排列的遺傳單位，基因是攜帶遺傳信息的結(jié)構(gòu)單位，又是控制遺傳性狀的功能單位?；虺幋a序列外還應(yīng)包括保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列及位于編碼區(qū)上游5’端的啟動(dòng)子非編碼序列、內(nèi)含子和位于編碼區(qū)下游3’端的終止子非編碼序列。編碼區(qū)是基因功能發(fā)揮的結(jié)構(gòu)基因（或稱功能基因），調(diào)控序列和啟動(dòng)子起調(diào)控啟動(dòng)作用，終止的非編碼區(qū)屬于調(diào)控基因。染色體總長(zhǎng)不到0.5m，而DNA分子總長(zhǎng)可達(dá)數(shù)米。染色體上的基因?yàn)镈NA分子。病毒基因組的特點(diǎn)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)?；蚪M由DNA或RNA組成，可為單鏈或雙鏈，亦可呈環(huán)狀或線狀?；蚪M小，含基因數(shù)少?；蚪M中存在調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄單元。有重疊基因存在。以RNA為基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒。典型的逆轉(zhuǎn)錄病毒有三個(gè)基因，即由gag（核心蛋白）、pol（逆轉(zhuǎn)錄酶）和env（包膜蛋白）組成，其基因結(jié)構(gòu)如圖所示：病毒基因組的特點(diǎn)RNA基因組的兩端含有U3RU5兩個(gè)完全相同的正向重復(fù)序列，從而在兩末端形成了長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）。LTR為激活、增強(qiáng)和調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的重要區(qū)段。因此LTR在人類基因組中的整合也可促進(jìn)其下游基因的活化和表達(dá)，如原癌基因被激活后致癌。U3U3RRU5U5病毒DNALTRLTRgagpolenv3'5'–DNA+DNA3'5'細(xì)菌基因組的特點(diǎn)由一條雙鏈DNA組成，為無(wú)核仁、核膜的原核結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)基因通常是單拷貝基因。而rRNA基因則是多拷貝的。細(xì)菌中的結(jié)構(gòu)基因中無(wú)內(nèi)含子，無(wú)核膜，一般是邊轉(zhuǎn)錄邊在胞漿中直接合成蛋白質(zhì)。無(wú)基因重疊結(jié)構(gòu)DNA分子中有多種功能調(diào)控區(qū)，如復(fù)制起始區(qū)、復(fù)制終止區(qū)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)等，這些區(qū)域常具有反向重復(fù)序列。細(xì)菌基因組的特點(diǎn)質(zhì)粒（plasmid）是染色體以外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀的DNA分子。不同細(xì)菌中的質(zhì)粒大小不一（103~105bp）。在酵母和其它真菌中也發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA的功能類型有三種：（1）F質(zhì)粒（F因子）由稱性質(zhì)粒?？刂凭纬?，利于定居，質(zhì)?？捎尚跃珌磉M(jìn)行質(zhì)粒傳遞和轉(zhuǎn)移；（2）R質(zhì)粒（抗藥性因子）能編碼一種或幾種抗菌素的抗性物質(zhì)；（3）col質(zhì)粒（大腸桿菌因子）質(zhì)粒中含有編碼大腸桿菌素的基因，編碼的大腸桿菌素可使近緣的細(xì)菌致死或抑制生長(zhǎng)。有的可編碼毒素。真核基因組C值和C值矛盾：一個(gè)單倍體基因組中的全部DNA量稱為該物種DNA的C值（Cvalue）。單拷貝序列：一部分與蛋白質(zhì)及酶類表達(dá)有關(guān)中度重復(fù)序列：通常是非編碼序列，與單拷貝基因間隔排列，少數(shù)成串排列在一個(gè)區(qū)域。高度重復(fù)序列多基因家族：、真核基因組中許多來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的基因在染色體上成串存在，這樣一組基因稱為基因家族（genefamily）?；虻男赂拍钜苿?dòng)基因（movablegene）又叫轉(zhuǎn)位因子（transposableelements），可以在染色體基因組上移動(dòng)，甚至可在不同染色體間躍遷，故又稱跳躍基因（jumpinggene），后來稱其為insertionsequences（現(xiàn)在一般叫ISelements）?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌中存在著三種類型的轉(zhuǎn)位因子，相對(duì)分子質(zhì)量小于2000bp的一般叫插入序列（IS），大于2000bp的稱為轉(zhuǎn)位子（Transposon，Tn），第三種類型為噬菌體Mu和D108。限制性核酸內(nèi)切酶分類和命名分類：即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型酶主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型1、限制和修飾作用單一多功能的酶分開的核酸內(nèi)切酶和甲基化酶具有一種共同亞基的雙功能酶2、限制酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的酶單一的成分2種不同的亞基3、限制作用所需輔助因子ATP、mg2+、S-腺苷甲硫氨酸mg2+ATP、mg2+（S-腺苷甲硫氨酸）4、切割位點(diǎn)可能隨機(jī)切割位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近距寄主特異性位點(diǎn)3'端24~26bp5、序列特異性的切割不是是是6、在DNA克隆中的用處無(wú)用非常有用有用限制酶的命名（1）用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母，組成的3個(gè)字母的略語(yǔ)表示寄主菌的物種名稱。例如大腸桿菌（escherichiacoli）用Eco表示，流感嗜血菌（haemophilusinfluenzae）用Hin表示。（2）用一個(gè)寫在右下方的標(biāo)注字母代表菌株或型，例如EcoR。如果限制和修飾體系在遺傳上是由病毒或質(zhì)粒引起的，則在縮寫的寄主菌的種名右下方附加一個(gè)標(biāo)注字母，表示為染色體外成分。例如EcoRI,EcoPI。（3）如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制與修飾體系，則以羅馬數(shù)字。如流感嗜血菌Rd菌株的幾個(gè)限制與修飾體系分別表示為HindI、HindII、HindIII等。（4）原先的命名現(xiàn)在得到簡(jiǎn)化，原則為：把所有略語(yǔ)字寫成一行；命名酶名稱不再特別標(biāo)出限制酶或修飾酶，即略去R與M字母。II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（1）在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子形成鏈的斷裂；（2）2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的；（3）斷裂的結(jié)果形成的DNA片段，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端，但平末端例外。絕大多數(shù)的II型限制酶都能識(shí)別由4、5、6或7個(gè)核苷酸組成的特定核苷酸序列。該序列稱為識(shí)別序列。DNA連接酶和DNA分子的體外連接目前已知有3種方法可以用來在體外連接DNA片段：第一種是用DNA連接酶連接具有粘性末端的DNA片段；第二種方法是用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段加上Poly（dA）-Poly(dT)尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來；第三種是，先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶連接。其它工具酶（1）大腸桿菌DNA聚合酶I（E.ColiDNAPolI）DNA聚合酶I由兩種亞基組成，帶有3種酶活性。它的大亞基相對(duì)分子量為7900，帶有聚合活性和3’外切核酸酶活性，小亞基只有5’外切核酸酶的活性。其它工具酶（2）DNA聚合酶I大片段（klenow酶）klenow酶的相對(duì)分子量為7600。是經(jīng)過Subtillisin（枯草桿菌）蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶，切除小亞基，只保留大亞基部分。所以這種酶具有DNA聚合酶的活性和3’外切酶的活性，但是沒有5’外切核酸酶活性。其它工具酶（4）逆轉(zhuǎn)錄酶這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA為DNA的酶。又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。其產(chǎn)物DNA又稱為cDNA，即互補(bǔ)DNA。最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（AMV）的逆轉(zhuǎn)錄酶，由和兩條亞基組成，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為65000和95000，這種酶具有聚合酶活性和外切割酶活性。（外切活性：如從DNA-RNA雜交鏈中特異性地降解RNA鏈，進(jìn)而保留新合成的DNA鏈。其它工具酶（5）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶從小牛胸腺或髓細(xì)胞中分離得到的，它催化DNA片段上的3’-OH端加接脫氧核苷酸。合成的方向是從底物的5’端向3’端進(jìn)行。（6）核酸酶S1是從半曲霉菌中分離得到，可以降解單鏈DNA和RNA，產(chǎn)生5’磷酸化單核苷酸或寡聚核苷酸。又稱單鏈特異的核酸酶。其它工具酶（7）核酸酶BAL31從乳白短桿菌細(xì)胞中分離的。它能以漸進(jìn)的方式從線型DNA分子的3’、5’兩邊同時(shí)降解，形成小的寡聚核苷酸片段或單核苷酸。在基因工程中可被用于組建DNA的物理圖譜以及造成克隆DNA分子的末端缺失。其它工具酶（9）T4多聚核苷酸激酶此酶能將ATP上的位磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’-OH上，酶作用底物是單鏈或雙鏈帶有5’-OH末端的DNA或RNA。其它工具酶（10）堿性磷酸酶從細(xì)菌中分離得到的堿性磷酸酶稱為BAP酶，從小牛內(nèi)臟中分離制備的酶稱為CAP酶。該酶的功能是以單鏈或雙鏈DNA、RNA為基質(zhì)，將DNA或RNA片段5’端的磷酸切除。質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體之外的一種遺傳成分，它是由環(huán)形雙鏈的DNA組成的復(fù)制