植物基因工程載體及其構(gòu)建課件

第八章

植物基因工程載體及其構(gòu)建第一節(jié)

植物基因工程載體種類第二節(jié)

根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能第三節(jié)

Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理第四節(jié)

Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建第五節(jié)

常用選擇標(biāo)記和報(bào)告基因植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)l

1.載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、病毒轉(zhuǎn)化載體）l

2.

DNA直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（原生質(zhì)體、基因槍）l

3.種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（花粉管通道法、生殖細(xì)胞浸泡法、胚囊子房注射法）。載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前植物基因工程中使用最多、機(jī)理最清楚、技術(shù)最成熟的、最重要的一種轉(zhuǎn)化系統(tǒng),其中又以Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體最為重要。

第一節(jié)

植物基因工程載體種類

根據(jù)其功能和構(gòu)建過(guò)程，可分為以下種類。（1）目的基因克隆載體：其功能是保存和克隆目的基因。與微生物基因工程相似，通常是由多拷貝的E.Coli小質(zhì)粒為載體。（2）中間克隆載體：是構(gòu)建中間表達(dá)載體的基礎(chǔ)質(zhì)粒。是由大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DNA片段、目的基因和標(biāo)記基因等構(gòu)建而成。（3）中間表達(dá)載體：是含有植物特異啟動(dòng)子的中間載體。是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。（4）卸甲載體：是解除武裝的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒，是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒。（5）植物基因轉(zhuǎn)化載體：是最后用于目的基因?qū)酥参锛?xì)胞的載體，亦稱工程載體。它是由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)建而成。

一、Ti質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能

1.Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型l

Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D,約有200kb組成。l

根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農(nóng)桿堿型（agropine）和農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)2.Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域

Ti質(zhì)?？煞譃樗膫€(gè)區(qū)。（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。

3.Ti質(zhì)粒的生物學(xué)功能Ti質(zhì)粒的功能可歸為以下7個(gè)方面:①

參與寄主細(xì)胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些細(xì)胞分裂素的活動(dòng)。②誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和冠癭堿成分。③

賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力。④

賦予寄主菌株對(duì)土壤桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素的反應(yīng)性。⑤

為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力。⑥

決定寄主菌株的植物寄主范圍。⑦

有的Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長(zhǎng)與發(fā)育，即具有對(duì)噬菌體的“排外性”。二、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)與功能

1.T-DNA的發(fā)現(xiàn)Chilton等人（1982）利用同位素標(biāo)記的Ti質(zhì)粒做探針發(fā)現(xiàn)，加入高濃度煙草腫瘤細(xì)胞的DNA后，Ti質(zhì)粒DNA的復(fù)性速度有加快的趨勢(shì)。這表明腫瘤DNA中有Ti質(zhì)粒的順序，但該順序不多，而且沒有檢測(cè)到完整的Ti質(zhì)粒。以后這些作者將章魚堿型的Ti質(zhì)粒B6-806用內(nèi)切酶SmaI分解成19個(gè)片段，分別用同位素標(biāo)記做成探針，然后與腫瘤DNA進(jìn)行分子雜交，結(jié)果有二段Ti質(zhì)粒的DNA（3b和10c。）能和腫瘤DNA雜交，也就是Ti質(zhì)粒中這兩段DNA是與腫瘤DNA同源的部分。進(jìn)一步研究證明，這部分DNA是從質(zhì)粒DNA上切割后，轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA（transferred-DNA）。這是首次證明在高等植物的細(xì)胞內(nèi)存在有微生物的DNA順序。3.T-DNA上的編碼基因及功能

T-DNA的轉(zhuǎn)錄有下述共同點(diǎn)：①T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈,即都能被轉(zhuǎn)錄。②T-DNA上每個(gè)基因都有各自的啟動(dòng)子。③基因的轉(zhuǎn)錄由植物細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ完成。④T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調(diào)節(jié)信號(hào)，在其5’端轉(zhuǎn)錄起始處有TATA和CAAT盒。同時(shí)AATAAA加尾信號(hào)也在同一條鏈上發(fā)現(xiàn)，故T-DNA的轉(zhuǎn)錄機(jī)理可能與真核生物相同。⑤植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調(diào)節(jié)基因活性。T-DNA區(qū)基因的功能

研究方法：用遺傳學(xué)方法在T-DNA區(qū)中引入轉(zhuǎn)座子，使特定的基因發(fā)生突變，從而在腫瘤細(xì)胞中T-DNA的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也隨之消朱?；蛲蛔兒蟛荒苻D(zhuǎn)錄出它所編碼的mRNA，這時(shí)可觀察到帶有突變基因的T-DNA的植物細(xì)胞的表型，從而確定這些基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的功能。用這種方法證明了編碼兩類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因序列：

T-DNA區(qū)編碼基因的功能

Aux基因突變將阻斷腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)素的大量合成，使細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)激素的比值升高。野生型腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值為0．22，而突變型該值上升到14.4，因此有利于芽的形態(tài)發(fā)生。同時(shí)Cyt基因突變將會(huì)阻斷細(xì)胞分裂素的大量合成，兩者之間的比值下降到0.02，因此有利于根的形態(tài)發(fā)生。正是由于Tms和Tmr基因的表達(dá)，使轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞內(nèi)激素平衡紊亂，冠癭瘤細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)，形成激素自主性特性，引起癌變。Tms和Tmr基因是致瘤所必須的基因，因此又稱它們?yōu)橹铝龌颍╫ncgene）。三、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能

1.Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)除T-DNA外，Ti質(zhì)粒的vir區(qū)也是農(nóng)桿菌致瘤所必須的。Vir區(qū)僅位于T區(qū)DNA左側(cè)。兩者之間的距離常隨Ti質(zhì)粒類型不同而有差異:Octopine的間隔距離較大,而Nopaline間隔距離很小。OctopineTi質(zhì)粒的Vir區(qū)大小為40bp,含有VirA、B、C、D、E、F、G、H(舊稱PinF)等8個(gè)操縱子(operon),共24個(gè)基因。它們協(xié)同調(diào)節(jié)，形成一個(gè)調(diào)控子(regulon),起共調(diào)控作用(co-regulation)。而Nopaline有7個(gè)操縱子,比Octoppine少一個(gè)VirF操縱子。

3.VirG操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)及功能VirG操縱子小于VirA，只有1.0kb，同樣是單基因結(jié)構(gòu)，只能編碼一條多肽，被稱為VirG蛋白，即DNA結(jié)合活化蛋白（DNA-bindingactivatorprotein）。它的C端已知有DNA結(jié)合活性。它的N未端部分具有磷酸化的酸性結(jié)構(gòu)。當(dāng)磷酸化的A蛋白將其磷酸基轉(zhuǎn)到VirG蛋白（30kD）保守的天冬氨酸鹽殘基上時(shí)，使VirG蛋白活化。活化的VirG蛋白可能以二體或多體形式結(jié)合到Vir區(qū)啟動(dòng)子的特定區(qū)域，從而成為其它Vir基因轉(zhuǎn)錄的激活因子，打開VirB、C、D、E、H等幾個(gè)基因。并己證明，VirA或VirG突變后會(huì)減弱或完全失去對(duì)其它Vir位點(diǎn)活化的誘導(dǎo)。VirA及VirG的這種調(diào)控作用被稱為雙因子調(diào)控體系（two一componentregu1atorysystem）。4.VirH、F及Tzs操縱子的誘導(dǎo)表達(dá)及其功能這些基因?qū)|(zhì)粒是特異性的，在Octopine中有VirF、VirH，在Nopaline中有Tzs。

VirH：可能對(duì)植物產(chǎn)生的某些殺菌或抑菌化合物起解毒作用，從而使農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)不受這些物質(zhì)的抑制，可增強(qiáng)致瘤能力。Tzs：大部分Nopaline菌株的Ti質(zhì)粒上均有Tzs基因,即轉(zhuǎn)運(yùn)玉米素合成酶基因（trans-zeatinsyntheasegene），在細(xì)菌中表達(dá)后將玉米素分泌到細(xì)胞外。該細(xì)胞分裂素被植物所吸收后，能促進(jìn)農(nóng)桿菌感染部位的植物組織脫分化和細(xì)胞分裂，提高植物對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的感受性。VirF操縱子編碼一個(gè)23kD蛋白，它與任何數(shù)據(jù)庫(kù)中所有蛋白質(zhì)的序列無(wú)明顯同源性。最近采用報(bào)告基因連接插入法研究發(fā)現(xiàn)，VirF在T-DNA運(yùn)輸時(shí)發(fā)揮作用。第三節(jié)

農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理

已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并非整個(gè)Ti質(zhì)粒都進(jìn)入植物細(xì)胞。該基因轉(zhuǎn)化過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的遺傳工程。1.T-DNA的復(fù)制

首先是在下鏈（或稱底鏈bottomstrand）25bp重復(fù)序列的右邊界左起第3和第4堿基間缺口剪切，然后從缺口3′端開始合成新的DNA鏈，并一直延伸到左邊界第22堿基處，置換出原來(lái)的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。NopalineT-DNA在缺口剪切后形成包括左右邊界在內(nèi)的單一T鏈，但OctopineT-DNA在剪切后則可形成6種T鏈，即TL、TC、TR、TL-TC、TC-TR,以及TL-TC-TR，這意味著邊界序列的剪切是相互獨(dú)立的。2.VirD1及VirD2的功能VirD1（16kD）及VirD2（47Kd）蛋白與T-DNA的加工有關(guān)，它決定在邊界重復(fù)序列的特定位點(diǎn)上形成切口，產(chǎn)生T鏈斷裂。VirD1及virD2突變，T-DNA邊界便不能缺口剪切并形成T鏈。這種缺口剪切可分成兩步：VirDl首先與25bp邊界序列親和結(jié)合，使邊界序列松弛，然后使VirD2可在特異位點(diǎn)剪切。VirD2至少有兩個(gè)功能，①特異剪切，并與T鏈的5′端共價(jià)結(jié)合,應(yīng)當(dāng)指出,農(nóng)桿菌并非以裸露的DNA分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞,而是T鏈的5′端與VirD2蛋白共價(jià)結(jié)合,這樣可使T鏈的5′端不受核酸酶的攻擊。②導(dǎo)向功能。已知僅VirD2蛋白分子N-端的50%已足以缺口剪切,形成T鏈。VirD2蛋白分子的另一半即C端可作為核定位的信號(hào),引導(dǎo)T鏈進(jìn)到植物的細(xì)胞核,故稱這為“向?qū)А?。這是因?yàn)镃端含有特異的氨基酸序列(核靶序列,nucleartargetngsequence)之故。

3.VirC的功能

VirC編碼兩種蛋白VirC1及VirC2蛋白。VirC1蛋白可特異地與OctopineTi質(zhì)粒上的超驅(qū)動(dòng)序列結(jié)合,從而促進(jìn)T-DNA邊界序列的缺口剪切。若VirC操縱子突變，則侵染性減弱。當(dāng)VirD1、VirD2不足時(shí),VirC1有促進(jìn)T-DNA加工的作用，但當(dāng)VirD1、VirD2高量表達(dá)時(shí),則VirC1對(duì)T鏈的形成無(wú)作用。VirC2蛋白的功能尚不清楚。

其它Vir基因產(chǎn)物與邊界缺口剪切及T鏈形成無(wú)關(guān)。三、T鏈復(fù)合體的轉(zhuǎn)運(yùn)及VirB的功能如上所述,T鏈復(fù)合體至少包括T鏈,VirD2及VirE2。VirD2及VirE2可能已足以保護(hù)Ｔ鏈并對(duì)Ｔ鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)起導(dǎo)向作用，但Ｔ鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)疑還需要其它活性物質(zhì)。這種活性物質(zhì)可能來(lái)自蛋白質(zhì)，可以是細(xì)菌和/或植物的特異蛋白。若為細(xì)菌蛋白，則可能是VirB蛋白。因?yàn)椋枣溵D(zhuǎn)運(yùn)的第一步是通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜，因此首先必須形成跨膜孔道，需有跨膜或膜結(jié)合蛋白的參與。

1.跨膜或膜結(jié)合蛋白有兩個(gè)主要特性

(1)穿膜通常需在蛋白質(zhì)的N端有一信號(hào)肽序列，這種蛋白可能獨(dú)立地或在類似伴隨蛋白受體幫助下穿越細(xì)菌內(nèi)膜（IM），特異肽酶在N端信號(hào)序列處剪切，產(chǎn)生成熟蛋白，并停止繼續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)。(2)有富含疏水殘基的約20個(gè)氨基酸的密接伸長(zhǎng)段（contiguousstretches）。向IM轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)可以（但非必須）在其N端含剪切的信號(hào)序列，但疏水伸長(zhǎng)段則有錨式功能，使蛋白質(zhì)駐留（1odging）在膜上。五、T鏈整合植物基因組

的分子機(jī)理

1.整合位點(diǎn)及其特性遺傳作圖的分析表明，T-DNA在植物染色體中的插入是隨機(jī)的。它可插入任何一條植物染色體。但插入位點(diǎn)常有以下特點(diǎn)：①T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點(diǎn)；②T-DNA與植物DNA連接處富含A，T堿基對(duì)；③植物DNA上的插入靶位點(diǎn)與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性。Matsumoto等人認(rèn)為正是由于這種同源性才使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地發(fā)生DNA鏈的交換。非常有趣的是他們還發(fā)現(xiàn)在植物基因組靶序列附近有一段（dG-dT）10序列。這種（dG一dT）10是真核基因組中保守的高度重復(fù)序列。當(dāng)DNA處于負(fù)超螺旋時(shí)，該重復(fù)序列極易形成Z-DNA，使位于它附近的序列部分解旋，為DNA重組、T-DNA插入提供位點(diǎn)。2.T-DNA的整合機(jī)理

Mayerhofer等從轉(zhuǎn)化的擬南芥菜中分離并測(cè)定插入的T-DNA及插入位點(diǎn)序列，發(fā)現(xiàn)T-DNA的插入使得靶序列缺失29～73bp。一部分整合的T-DNA片段不完整，兩端均有缺失。靶序列斷裂處與插入的T-DNA兩端有部分重疊。另一部分整合的T-DNA卻保持完整。其中一些插入的T-DNA能精確地取代植物靶序列，其右邊界與靶序列連接，T-DNA左未端和靶序列裂口同源。還有一種情形則是，T-DNA插入片段的未端與缺失的靶序列裂口處并無(wú)同源性，而是在其內(nèi)部有部分短片段與T-DNA未端同源。在靶序列裂口處還發(fā)現(xiàn)有DNA序列的倒位或重復(fù)。T-DNA的整合是異常重組（illegitimaterecombination）的結(jié)果。T-DNA右未端在靶序列的識(shí)別及連接中是必需的，T-DNA左未端和兩個(gè)靶DNA未端則參與部分配對(duì)和DNA修復(fù)。3.T-DNA整合的遺傳效應(yīng)

T-DNA插入的位點(diǎn)不同，可使轉(zhuǎn)基因植物具有不同的表型和遺傳特性，即所謂位點(diǎn)效應(yīng)（positioneffect）。已知T-DNA可插入多個(gè)物理位點(diǎn)。遺傳位點(diǎn)數(shù)一般少于或等于插入的物理位點(diǎn)數(shù)，這是因?yàn)榧谆墒够虿槐磉_(dá)，或者幾個(gè)拷貝連鎖在一起。多拷貝的T-DNA可插入不同的獨(dú)立位點(diǎn)，或可首尾串聯(lián)（trandem）插入同一位點(diǎn)，多拷貝T-DNA進(jìn)人同一植物細(xì)胞后，這些拷貝之間可能相互作用，導(dǎo)致基因的沉默，這種現(xiàn)象現(xiàn)被稱為共抑制（co-supression）。T-DNA插入的遺傳特性：(1)T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會(huì)導(dǎo)致靶位點(diǎn)處小的缺失，缺失多至79個(gè)核苷酸。(2)另一個(gè)常見的結(jié)果是，在T-DNA／植物DNA連接處，會(huì)有幾個(gè)至33個(gè)核苷酸的“填充”DNA（FillerDNA）存在，這些“填充”DNA的序列與靠近連接處的植物DNA序列相似。(3)在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列（5～10b）同源，則可以在整合中起作用。六、農(nóng)桿菌染色體基因?qū)-DNA轉(zhuǎn)移的調(diào)控

目前已發(fā)現(xiàn)位于細(xì)菌染色體上的一些基因也和T-DNA的轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且已經(jīng)了解它們編碼的蛋白質(zhì)的功能。ChvA、ChvB、ChvC參與細(xì)菌的附著功能；Cel位點(diǎn)與細(xì)菌表面纖維絲的合成有關(guān);Att基因影響農(nóng)桿菌細(xì)胞表面蛋白的合成；ivr基因的突變能使農(nóng)桿菌細(xì)胞表面的脂多糖發(fā)生改變而影響農(nóng)桿菌宿主范圍；PscA和ExoC基因與多糖合成有關(guān)，并影響農(nóng)桿菌附著能力。以上這些基因的突變將使細(xì)菌表面成分發(fā)生變化，從而喪失與植物細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合的能力。此外，ChvD位點(diǎn)影響AS對(duì)毒性區(qū)的誘導(dǎo)效率和農(nóng)桿菌的致瘤能力。CbvE位點(diǎn)編碼一個(gè)單糖結(jié)合蛋白，與單糖影響Vir區(qū)的表達(dá)有關(guān)。Ros基因與Vir基因的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)?？梢?，目前已知農(nóng)桿菌染色體上有10個(gè)基因與T-DNA轉(zhuǎn)移有關(guān)。第四節(jié)

農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建

一、Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建二、中間載體的構(gòu)建三、中間表達(dá)載體的構(gòu)建四、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建一、Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建

野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：①Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大，一般在160～240kb，比pBR322質(zhì)粒大50倍左右，在基因工程中難以操作；②大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)，不論用何種限制酶切割，都會(huì)被切成很多片段，因此難以找到可利用的單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，不能通過(guò)體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因；③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；而農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率極低（10％左右）,因此，通過(guò)Ti質(zhì)粒的體外操作，在常規(guī)分子克隆條件下幾乎不能構(gòu)建在T-DNA中只有單一切點(diǎn)的載體；⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。

為了使Ti質(zhì)粒成為有效的外源基因?qū)胼d體，必須對(duì)野生型Ti質(zhì)粒進(jìn)行一番科學(xué)的改造。十分幸運(yùn)的是，大腸桿菌具有能與農(nóng)桿菌高效地接合轉(zhuǎn)移的特性。因此，科學(xué)家們可以先將T-DNA片段克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒中，并插入外源基因，最后通過(guò)接合轉(zhuǎn)移把外源基因引入到農(nóng)桿茵的Ti質(zhì)粒上，這是一種把預(yù)先進(jìn)行亞克隆、切除、插入或置換的T-DNA引入Ti質(zhì)粒的有效方法。帶有重組T-DNA的大腸桿菌質(zhì)粒衍生載體稱為”中間載體”（intermediatevector），而接受中間載體的Ti質(zhì)粒則稱為受體Ti質(zhì)粒（acceptorTip1asmid），一般是卸甲載體（disarmedvector）。1．

Onc-卸甲載體

所謂卸甲載體就是無(wú)毒的（non-oncogenic）Ti質(zhì)粒載體。因?yàn)槔靡吧偷腡i質(zhì)粒作載體時(shí)，影響植株再生的直接原因是T-DNA中Onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的Ti質(zhì)粒成為基因轉(zhuǎn)化的載體，必須切除T-DNA上的Onc基因，即“解除”其“

武裝”,構(gòu)建成所謂“卸甲”或稱“繳械”載體（disarmedvector）。在這種Onc-載體中，已經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用的質(zhì)粒pBR322取代。這樣任何適合于克隆在pBR322質(zhì)粒中的外源DNA片段，都可以通過(guò)與pBR322質(zhì)粒DNA的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質(zhì)粒載體上。2.Onc十卸甲載體

對(duì)于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)，以及對(duì)于以改良農(nóng)作物為目的的植物基因工程而言，Onc一體系是最有用的。不過(guò)，人們可能還要設(shè)計(jì)一些特殊的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究外源基因在冠癭瘤組織中的表達(dá)問(wèn)題。在這種情況下，使用Onc十

菌株載體則比較合適。由于冠癭瘤組織具有不依賴于激素的表型特征，所以這種載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于它可以快速地增生冠癭組織，比較快速而容易得到轉(zhuǎn)化體。二、中間載體的構(gòu)建

1.中間載體的基本結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)為解決Ti質(zhì)粒不能直接導(dǎo)入目的基因的困難，構(gòu)建中間載體（intermediatevector）是有效方法之一。中間載體是一種在一個(gè)普通大腸桿菌的克隆載體（例如pBR322質(zhì)粒）中插入了一段合適的T-DNA片段，而構(gòu)成的小型質(zhì)粒。中間載體通常是多拷貝的E.Coli小質(zhì)粒，這一點(diǎn)對(duì)于通過(guò)體外遺傳操作導(dǎo)入外源基因是非常必要的。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)看可分為兩類中間載體，即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元載體系統(tǒng)中間載體。共整合系統(tǒng)中間載體的特征①中間載體必須含有與Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌農(nóng)桿菌后即可高頻地與Ti質(zhì)粒的T-DNA的同源序列進(jìn)行重組；②它應(yīng)具有一個(gè)或幾個(gè)細(xì)菌選擇標(biāo)記，這將有利于篩選共整合質(zhì)粒；③它必須

有bom位點(diǎn)，在有誘導(dǎo)質(zhì)粒存在的情況下，bom位點(diǎn)的存在可以使中間載體在不同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移；④它應(yīng)該含有陽(yáng)性植物選擇標(biāo)記，以利于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinphosphotransferase,Npt-Ⅱ)基因，其可賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞卡那霉素抗性；⑤它應(yīng)該含有單一的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，以利于外源基因的插入；⑥無(wú)Ti質(zhì)粒的邊界序列。雙元載體系統(tǒng)的中間載體與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處是①無(wú)同源序列；②具有LB和RB;③無(wú)Co1E1復(fù)制點(diǎn)

三、中間表達(dá)載體的構(gòu)建中間載體從功能看可分為兩大類，即克隆載體和表達(dá)載體?？寺≥d體的主要功能是復(fù)制和擴(kuò)增基因；表達(dá)載體是適于在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。

上述構(gòu)建的中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞后，插入的外源基因能否得到表達(dá)是一個(gè)十分重要的問(wèn)題。研究表明，早期曾通過(guò)各種中間載體引入的外源基因，如轉(zhuǎn)座子的抗生素抗性基因、酵母的乙醇脫氫酶基因、動(dòng)物的β-珠蛋白基因和干擾素基因等，均未能在植物中表達(dá)。這是因?yàn)檫@些外源基因都缺乏特異啟動(dòng)子的緣故，后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在中間載體中加上能在植物細(xì)胞中表達(dá)的各種啟動(dòng)子后，可使外源基因能在植物細(xì)胞中表達(dá)。這類含植物特異啟動(dòng)子的中間載體就稱為中間表達(dá)載體（intermediateexpressionvector）。1．啟動(dòng)子及其它調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)控對(duì)真核生物基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。就真核生物基因表達(dá)調(diào)控序列而言，大多數(shù)真核生物在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5′端上游區(qū)第30至25bp處具有TATA盒，在70至80bp處還有CAAT盒。在大多數(shù)真核生物基因的3′端具有AATAA序列。這些5′和3′端的調(diào)控序列對(duì)真核生物的基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。Ti質(zhì)粒雖然來(lái)源于農(nóng)桿菌，

但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有與真核生物啟動(dòng)子類似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物細(xì)胞中表達(dá)，并且無(wú)組織特異性。因此，它們成為早期構(gòu)建嵌合基因的啟動(dòng)子，其中以Nos啟動(dòng)子（pNos）最常用。1．啟動(dòng)子及其它調(diào)控序列近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),來(lái)自花椰菜花葉病毒DNA的CaMV的35s啟動(dòng)子能使嵌合的外源基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，并表現(xiàn)出強(qiáng)烈的表達(dá)功能。由CaMV35s啟動(dòng)子、外源結(jié)構(gòu)基因及Nos3′端的非編碼區(qū)域組成的嵌合基因，能在植物細(xì)胞中很快高效表達(dá)。CaMV35s啟動(dòng)子既無(wú)組織特異性，又不受發(fā)育時(shí)期的影響，是一個(gè)理想的植物基因工程的啟動(dòng)子。另外，近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)，19s啟動(dòng)子亦能使嵌合基因在植物細(xì)胞中表達(dá)。近年來(lái)，從植物基因中分離出組織特異表達(dá)啟動(dòng)子及誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子，為實(shí)現(xiàn)外源基因的定時(shí)、定位高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

2.嵌合基因（chimericgene）構(gòu)建

所謂嵌合基因就是來(lái)自兩種或兩種以上生物的啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)基因、終止子連接在一起構(gòu)成基因。3中間表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中間表達(dá)載體是由中間載體加上能在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子及基因構(gòu)成，也就是嵌合基因插入中間載體后構(gòu)成，所以中間載體的構(gòu)建是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程。

下面以pLGV2381為例簡(jiǎn)要地說(shuō)明其構(gòu)建過(guò)程。（見圖8-1）四、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建上述構(gòu)建的中間表達(dá)載體仍然不能直接作為植物外源基因轉(zhuǎn)化的載體，因?yàn)橹虚g表達(dá)載體仍是一種細(xì)菌的質(zhì)粒，不能把外源基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞。因此，必須進(jìn)一步把中間載體引入到上述已改造的受體Ti質(zhì)粒中，并構(gòu)建成能侵染植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化載體，才能應(yīng)用于植物基因的轉(zhuǎn)化。它是由兩種以上質(zhì)粒構(gòu)成的復(fù)合型載體，故稱之為載體系統(tǒng)。近年來(lái)的研究已經(jīng)建立許多種載體系統(tǒng)，但目前主要采用兩種Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，即一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。1．一元載體系統(tǒng)的構(gòu)建這一類載體是中間表達(dá)載體與改造后的受體Ti質(zhì)粒之間，通過(guò)同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，通常亦稱為共整合載體（co-intergratedvecter），又由于該載體的T-DNA區(qū)與Ti質(zhì)粒Vir區(qū)連鎖，因此又稱之為順式載體（cis-vector）。一元載體的特點(diǎn)是:①由兩個(gè)質(zhì)粒（E.coli質(zhì)粒和Ti質(zhì)粒）重組而成，分子量較大；②共合體的形成頻率與兩個(gè)質(zhì)粒的重組頻率有關(guān),相對(duì)較低；③必須用Southern雜交或PCR對(duì)大的共整合體質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)；④構(gòu)建時(shí)比較困難。一元載體系統(tǒng)目前主要有兩種載體：共整合載體和拼接未端載體（split-endvector,SEV）。

（1）共整合載體的構(gòu)建共整合載體的特點(diǎn)是：①中間表達(dá)載體與受體Ti卸甲載體，通過(guò)同源重組共整合而構(gòu)建；②中間表達(dá)載體與受體Ti質(zhì)粒之間同源序列是pBR322。共整合載體的構(gòu)建過(guò)程l）中間載體pLGV1103導(dǎo)入農(nóng)桿菌:目前通常采用兩種方法，即接合轉(zhuǎn)移法（conjugativetransfer）和三親雜交轉(zhuǎn)移法。2）中間載體與受體Ti質(zhì)粒的同源重組。3）共整合載體的選擇。

（2）SEV的構(gòu)建SEV系統(tǒng)即T-DNA邊界拼接系統(tǒng)，亦稱拼接末端載體（sp1it-endvecter,SEV）。它是由Freley等人于1985年建立的另一種共整合載體，也因?yàn)樗膬蓚€(gè)LIH序列在同源重組前分別處于不同質(zhì)粒上而得名。SEV與pGV3850的差異及構(gòu)建過(guò)程如下述：1）SEV的受體Ti質(zhì)粒的T-DNA上的致瘤基因（onc）及TR都已被缺失，T-DNA的保留部分被稱為“左邊界內(nèi)部同源區(qū)”（1eftinsidehomcology，LIH）。該受體Ti質(zhì)粒還保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同時(shí)還攜有用于細(xì)菌篩選的抗性基因。2）SEV中間載體具有一個(gè)細(xì)菌的抗性基因，一個(gè)植物抗性基因及與受體Ti質(zhì)粒同源的LIH序列及TR。3）通過(guò)三親雜交將中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，由于它們之間都具有LIH同源序列，即可發(fā)生同源重組，形成SEV的共整合載體。

（3）SEV與pGV3850比較兩者都是通過(guò)受體Ti質(zhì)粒與中間載體同源重組而形成，故同屬于共整合的一元載體系統(tǒng)，但它們之間有著一定的差異：1）它們的受體Ti質(zhì)粒與中間載體的結(jié)構(gòu)不同。pGV3850的左右邊界在一個(gè)受體Ti質(zhì)粒上，而SEV來(lái)自二個(gè)質(zhì)粒，即TR來(lái)自中間載體。、2）同源序列不同。pGV3850重組的同源序列是pBR322，而SEV是LIH。3）SEV是更有效的共整合載體。由于pGV3850共整合載體，帶有大腸桿菌pBR322序列，外源基因嵌合在該序列中，因而轉(zhuǎn)化的植物中也帶有重復(fù)的pBR322序列。此重復(fù)序列可能對(duì)轉(zhuǎn)化植物中的外源基因的穩(wěn)定性有影響，而SEV系統(tǒng)則排除了這種可能。2．雙元載體系統(tǒng)

雙元載體（binaryvecter）系統(tǒng)是指由兩個(gè)分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng),又因?yàn)槠銽-DNA與Vir基因在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上，通過(guò)反式激活T-DNA轉(zhuǎn)移,故稱之為反式載體（transvecter）.（1）雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建原理雙元載體主要包括兩個(gè)Ti質(zhì)粒，即微型Ti質(zhì)粒和輔助Ti質(zhì)粒。

Ti質(zhì)粒上的Vir基因與T-DNA具有反式互補(bǔ)作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的轉(zhuǎn)移。其次，中間載體含有廣泛寄主范圍質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)（oriV），而代替了共整合載體中用以重組的同源區(qū)，能夠在任何農(nóng)桿菌寄主里自發(fā)復(fù)制。（2）微型Ti質(zhì)粒（mini-Tiplasmid）雙元載體系統(tǒng)是在微型Ti質(zhì)?；A(chǔ)上產(chǎn)生的。所謂微型質(zhì)粒就是含有T-DNA邊界、缺失vir基因的Ti質(zhì)粒。Mini-Ti是一個(gè)廣譜質(zhì)粒，除含有T-DNA（左、右邊界）外，還具有廣譜質(zhì)粒的復(fù)制位點(diǎn)oriV及選擇標(biāo)記基因。Bevan等（1984）構(gòu)建的pBinl9微型質(zhì)粒（圖822）是應(yīng)用得最廣泛的Mini-Ti。它含有來(lái)自pTiT37的T-DNA左右邊界序列，在兩個(gè)邊界序列之間的T-DNA區(qū)含有植物選擇標(biāo)記NptII基因，以及來(lái)自噬菌體M13mpl9的多種酶連接接頭的LacZ基因。在LacZ基因內(nèi)部含有多克隆位點(diǎn)，外源基因可以便利地插入其間使其本身失活。此外，Binl9含有廣宿主質(zhì)粒Rk2的復(fù)制和轉(zhuǎn)移的起始位點(diǎn)。（3）輔助Ti質(zhì)粒含有Vir區(qū)段的Ti質(zhì)粒稱為輔助Ti質(zhì)粒（he1perTi）。實(shí)際上輔助Ti質(zhì)粒是T-DNA缺失的突變型Ti質(zhì)粒，完全喪失了致瘤功能，因此是相當(dāng)于在共整合載體系統(tǒng)中的卸甲Ti質(zhì)粒（disarmedTi）。其主要作用是提供Vir基因功能，激活處于反式位置上的T-DNA轉(zhuǎn)移，該卸甲載體在此又稱之為輔助Ti質(zhì)粒（he1perTi）。

最常用的輔助Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌LBA4404所含有的Ti質(zhì)粒pAL4404。其為章魚堿型Ti質(zhì)粒pTiAch5的衍生質(zhì)粒，其T-DNA區(qū)已發(fā)生缺失突變，但仍保存有完整的Vir基因功能。近年來(lái)的研究表明，野生型的Ti質(zhì)粒即不卸甲的Ti質(zhì)粒，同樣可以作為輔助Ti質(zhì)粒，而且具有更強(qiáng)毒性。

（4）雙元載體的構(gòu)建將MiniTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有He1perTi質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌的途徑有兩條，一條是直接用純化的MiniTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化速凍的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；另一條是與共整合載體構(gòu)建一樣，采用三親接合的方式。MiniTi質(zhì)粒均能以E.coli的pRK2013為輔助質(zhì)粒，通過(guò)三親雜交而接合轉(zhuǎn)移到含有輔助Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)。由于E.coli的pRK2013不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制最后消失，含有MiniTi質(zhì)粒和He1perTi質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌可直接用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

（5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較

綜上所述，雙元載體系統(tǒng)與一元載體系統(tǒng)之間有著較大的差異：1）雙元載體不需要共整合過(guò)程，因此系統(tǒng)中的兩個(gè)質(zhì)粒不必含有同源序列。2）Mini-Ti質(zhì)粒具有E.coli質(zhì)粒的復(fù)制位點(diǎn)、能在農(nóng)桿菌的寄主中復(fù)制，使其質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加10～100倍，而且Mini-Ti質(zhì)粒分子量小（10kb），可以直接進(jìn)行體外遺傳操作。3）雙元載體不需經(jīng)過(guò)兩個(gè)質(zhì)粒的共整合過(guò)程，因此構(gòu)建的操作步驟比較簡(jiǎn)單。。4）由于mini-Ti質(zhì)粒較小，并無(wú)共整合過(guò)程，因此質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌比較容易，而且構(gòu)建的頻率較高。（5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較5）由于根癌農(nóng)桿菌感染的寄主范圍是由Vir基因及染色體上的基因決定的，因此，使用雙元載體系統(tǒng)更便于根據(jù)轉(zhuǎn)化材料的來(lái)源不同選擇適宜的He1per系統(tǒng)。6）雙元載體在外源DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞前，無(wú)需進(jìn)行同源重組，插入載體的外源基因變異可能要比pGV3850系統(tǒng)來(lái)得小。

7）共整合載體系統(tǒng)比雙元載體系統(tǒng)更難以應(yīng)用，通常一個(gè)共整合載體在用于植物轉(zhuǎn)化之前，應(yīng)弄清Ti質(zhì)粒的拷貝數(shù)和大小，所以必須通過(guò)southern雜交來(lái)鑒定。8)共整合載體的重組頻率很低，而雙元載體系統(tǒng)的兩個(gè)質(zhì)粒接合的頻率較高，一般至少高4倍，因此雙元載體的構(gòu)建頻率較高。9）共整合載體構(gòu)建成功后，工程菌的穩(wěn)定性較好，雙元載體穩(wěn)定性較差，容易丟失。10）雙元載體在外源基因的植物轉(zhuǎn)化中效率高于共整合載體。3．載體卡盒當(dāng)一個(gè)動(dòng)植物的外源基因插入轉(zhuǎn)錄載體后實(shí)現(xiàn)表達(dá)的水平高低十分重要，高效表達(dá)系統(tǒng)的建立在基因工程中非常有用。所以科學(xué)家們不斷地構(gòu)建一些復(fù)雜的載體來(lái)提供全部必須的表達(dá)信號(hào)。最近幾年來(lái)，更先進(jìn)的一代表達(dá)載體已得到發(fā)展。這些載體以卡盒形式提供基因表達(dá)所需的全部信號(hào)，包括啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子等。然后新的外源基因被插入到表達(dá)信號(hào)簇中間的唯一限制性切點(diǎn)，所以稱之為盒式載體。在植物基因轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建中同樣采用了上述原理構(gòu)建成載體卡盒。所謂載體卡盒(vectercassette)（圖8-23）是將植物標(biāo)記基因、多克隆位點(diǎn)、細(xì)菌標(biāo)記基因和廣譜質(zhì)粒的復(fù)制和動(dòng)員功能均集于一身的集裝箱似的載體系統(tǒng)。利用載體卡盒可以更便利地構(gòu)建基因轉(zhuǎn)化載體。五、載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記及報(bào)告基因如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個(gè)重要問(wèn)題?？茖W(xué)家家一直試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個(gè)標(biāo)記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標(biāo)記基因，并已插入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標(biāo)記基因。（不論是選擇標(biāo)記基因還是篩選標(biāo)記基因，后者亦稱報(bào)告基因）都必須具備以下四個(gè)條件：①編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；④檢測(cè)容易，并且能定量分析。選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因除具有上述共同之處外，它們?cè)诠δ芎托再|(zhì)上還有一定差異。選擇標(biāo)記基因的功能主要是該基因的產(chǎn)物給予植物細(xì)胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長(zhǎng)等，從而將轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇出來(lái)，例如，Cat（氯霉抗性基因）。篩選標(biāo)記基因強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識(shí)別作用，故稱報(bào)告基因。

1．選擇標(biāo)記的應(yīng)用

選擇標(biāo)記的功能是在選擇壓力下把轉(zhuǎn)化體選擇出來(lái)。為達(dá)到這一目的，首先要在選擇培養(yǎng)基中加入選擇劑，產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育。其次是選擇標(biāo)記基因的產(chǎn)物對(duì)選擇劑產(chǎn)生抗性，致使轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受選擇劑的影響，能正常生長(zhǎng)、發(fā)育、分化，從而把轉(zhuǎn)化體選擇出來(lái)。近年來(lái)已研究出較多的選擇標(biāo)記基因。在選擇標(biāo)記的使用中值得注意的是標(biāo)記基因的正確選擇。沒有一種標(biāo)記在所有的植物全都行之有效；不同的標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及轉(zhuǎn)化率有著明顯的影響；即使是同一種標(biāo)記基因，在不同的選擇