第二章基因工程的酶學(xué)

第二章基因工程的酶學(xué)第1頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一模板序列第2頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第3頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第4頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)Enzymes第5頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第6頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第7頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一(II類)限制性內(nèi)切酶

限制性內(nèi)切酶的存在給沒給基因工程操作帶來麻煩？限制性內(nèi)切酶在基因工程操作中有哪些具體用途？第8頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。(II類)限制性內(nèi)切酶

分離的第一個(gè)酶是HindⅡ第9頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一一、限制性內(nèi)切酶的基本特性

是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（1）識(shí)別位點(diǎn)4—8bp，回文結(jié)構(gòu)思考題1、在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一個(gè)6bp的II類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，該位點(diǎn)的序列可能是什么？2、下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)（哪些）最有可能是II類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列：GAATCG,AAATTT,GATATC,ACGGCA?為什么？第10頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（2）內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式1986年J.A.McClarin等通過X射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以同型二聚體的形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG第11頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（3）切割位點(diǎn)EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生？末端EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生？末端切開雙鏈DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齊末端（bluntend）。如：識(shí)別位點(diǎn)處。第12頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（4）粘性末端（stickyends，cohensiveends）含有幾個(gè)核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點(diǎn)）GAATTC

CTTAA

GG

AATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’第13頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一CTGCAG

②3’端凸出（如PstI切點(diǎn)）GACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAG

G

ACGTC第14頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一

①連接便利（5）粘性末端的意義只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。第15頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第16頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端標(biāo)記，3’末端加尾凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。第17頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。（6）同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’第18頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：第19頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等（7）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。第20頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一5’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識(shí)別。？5’-G3’-CCTAGGATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A第21頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一二、DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響

限制酶切割DNA時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是說在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。第22頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一

在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇酶切秩序。溫馨提示——Becareful第23頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測(cè)）限制酶

待測(cè)的寡核苷酸序列待測(cè)的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表2-4：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測(cè)）限制酶

待測(cè)的寡核苷酸序列待測(cè)的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0限制酶待測(cè)的寡核苷酸序列待測(cè)的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0表1：靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測(cè)）

第24頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一

某些限制酶對(duì)同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性切割，即對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。三、位點(diǎn)偏愛（Sitepreference）第25頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一

λ噬菌體DNA為48502bp，含12bp粘端。EcoRⅠ酶切割噬菌體中的5個(gè)位點(diǎn)時(shí)并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快10倍；

某些噬菌體DNA中的某些相同的酶切位點(diǎn)對(duì)酶的敏感性是不同的。如：第26頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一四、在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行酶切20微升反應(yīng)體系第27頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一五、酶切反應(yīng)條件終止酶切的方法緩沖液反應(yīng)溫度反應(yīng)時(shí)間第28頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一緩沖液(Buffer)（1）緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。第29頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525溫度第30頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一

EcoRⅠ若反應(yīng)16小時(shí)，所需酶量為正常酶切時(shí)間的1/8，即若反應(yīng)時(shí)間為16小時(shí)，則所用酶量為只切1小時(shí)的1/8。

反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間通常為1小時(shí)或更多，許多酶延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可減少酶的用量。例如：第31頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一終止酶切的方法苯酚加熱EDTA第32頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一

EDTA可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng)，終止?jié)舛葹?0mM；

加熱是常用的方法，對(duì)于最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶，在65℃或80℃處理20分鐘可使酶活性大部分喪失。

對(duì)于在80℃作用20分鐘也有不失活的酶可用苯酚抽提去除蛋白，或用試劑盒純化DNA。第33頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一與酶切反應(yīng)條件相關(guān)的兩個(gè)現(xiàn)象第34頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一

在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱。星號(hào)（*）活性。1、星號(hào)（*）活性第35頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一EcoRI和BamHI等都有*活性。在低鹽、高pH（>8）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的時(shí)候要特別注意！第36頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一內(nèi)切酶在DNA上的所有識(shí)別位點(diǎn)都被切開。2、完全消化與局部消化123412341）、完全消化第37頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。2）、局部消化123414第38頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一

請(qǐng)確定XbaI,XhoI和KpnI位點(diǎn)在DNA上的相對(duì)位置。第39頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第40頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一六、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素外因內(nèi)因

外因是可預(yù)見和控制的，如反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時(shí)加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積的選擇以及反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短等等

內(nèi)因包括位點(diǎn)偏愛性、甲基化底物、底物的構(gòu)象。構(gòu)象的影響主要指切割線性DNA和超螺旋DNA時(shí)的活性，如與切割DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶來切割pBR322的超螺旋DNA第41頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第二節(jié)DNA連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口。第42頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（1）大腸桿菌連接酶1.兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。二、DNAligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。第43頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：NAD+2.連接條件第44頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、連接反應(yīng)的機(jī)理2.ATP與連接酶形成共價(jià)“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。3.AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi第45頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一4.AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP第46頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一5.3‘-OH對(duì)磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。第47頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。四、連接反應(yīng)的溫度1.最佳溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2.實(shí)用溫度所以一般采用4~16C。第48頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1.插入片段與載體的濃度比例2.反應(yīng)溫度12.5℃。五、影響連接反應(yīng)的因素10~20倍。一般14~16℃第49頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)DNA聚合酶(自學(xué))一、基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修飾過的T7DNA聚合酶6.逆轉(zhuǎn)錄酶第50頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一1.共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—OH端。2.主要區(qū)別T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。第51頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常用DNA聚合酶的特性比較第52頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1.大腸桿菌DNA聚合酶I主要用來制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)①一條單鏈多肽。②5’3’外切酶活性位于N端。③用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。第53頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③帶有3’—OH游離端的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶I（PolI）的反應(yīng)條件-OH5’3’dNTPs第54頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一標(biāo)記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補(bǔ)的待測(cè)序列雜交第55頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一標(biāo)記已知序列的核酸片斷②探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5’3’第56頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一③DNA聚合酶I對(duì)探針序列的標(biāo)記缺口轉(zhuǎn)移法(nicktranslation)：放射性同位素標(biāo)記：DNA聚合酶I同時(shí)具備5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。第57頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一5’3’外切酶活性從DNA缺口的下一段DNA5’端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會(huì)在缺口的上一段DNA的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。缺口缺口5’5’3’3’5’3’5’3’第58頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移一種-32P-dNTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標(biāo)記8第59頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草桿菌蛋白酶第60頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一①3’端補(bǔ)平5’5’klenow②DNA3’末端標(biāo)記補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途第61頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一3’隱蔽末端的DNA片斷Klenowfragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h第62頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物第63頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（1）T4DNA聚合酶的性質(zhì)3.T4DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性（降解單鏈更快）。①來源②酶活性第64頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一③特點(diǎn)當(dāng)沒有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能，制造出3’隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP的位置。第65頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶無dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’第66頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（2）T4DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法）用3’5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隱蔽端、5’隱蔽端）制造出3’隱蔽端。再利用它的5’3’聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的dNTP。①補(bǔ)平隱蔽末端②DNA3’末端標(biāo)記第67頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’5’外切）DNA酶切片斷T4DNA聚合酶（5’3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內(nèi)切酶切無dNTPs第68頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一a.放射性標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：制作簡(jiǎn)單、高比放射性、放射自顯影效果好。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、對(duì)人體有害。要求在專門實(shí)驗(yàn)室操作。第69頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一b.非放射性標(biāo)記i）生物素標(biāo)記：生物素（biotin），又稱維生素H、輔酶R可以與dNTP?；Y(jié)合成為生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素連接酶（biotinligase）催化與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。第70頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一純化的DNA片斷DNaseI制造單鏈缺口DNAPolI進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移生物素-dTTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口轉(zhuǎn)移法將生物素?fù)饺隓NA探針中第71頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一光促生物素標(biāo)記生物素連接臂光敏基因探針序列探針序列生物素連接臂光敏基因+光照第72頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一抗生物素蛋白（avidin）：鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的識(shí)別——親和素：是一種雞卵清蛋白。細(xì)菌中avidin的類似物。能與生物素特異結(jié)合的蛋白或抗體，常用：第73頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一ii）地高辛標(biāo)記：可以與dNTP連接成地高辛-dUTP等，參入DNA合成過程。形成地高辛標(biāo)記的DNA探針。生物素和地高辛標(biāo)記的探針都有商品化的試劑盒(kit)。地高辛的結(jié)合物是抗地高辛抗體。第74頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第75頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一iii）偶聯(lián)酶及其底物常用的兩種酶：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）堿性磷酸酶（AlkalinePhosphatase,AP）催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中發(fā)出熒光（或生成有色的產(chǎn)物）。酶的作用：第76頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一化學(xué)發(fā)光底物第77頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一HRPO和AP的顯色反應(yīng)底物第78頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一發(fā)光反應(yīng)機(jī)理第79頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一iv）用非放射性標(biāo)記的探針檢測(cè)原理生物素探針序列待測(cè)基因親和素酶底物中間產(chǎn)物產(chǎn)物發(fā)光探針DNA用生物素或地高辛標(biāo)記。親和素或地高辛抗體與酶偶聯(lián)。酶催化一個(gè)發(fā)光或顯色反應(yīng)。親和素或地高辛抗體與生物素或地高辛結(jié)合。第80頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一核酸探針雜交篩選法的缺點(diǎn)是：只檢測(cè)是否有外源DNA插入，而不論該DNA是否表達(dá)出產(chǎn)物。第81頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一4.T7DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個(gè)亞基組成：①T7基因5編碼的大亞基：有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性。②大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。增加大亞基對(duì)模板的親和性。第82頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（2）T7DNA聚合酶的特點(diǎn)①持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。②3’5’外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。③不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙第83頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一②進(jìn)行末端標(biāo)記①以大分子量DNA為模板的合成如M13③補(bǔ)平隱蔽末端（3）T7DNA聚合酶的用途取代合成法標(biāo)記3’末端。與T4DNA聚合酶相同。合成補(bǔ)平3’隱蔽末端；水解修平3’突出末端。第84頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一5.修飾后的T7DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7DNA聚合酶的用途①DNA測(cè)序雙脫氧法。②標(biāo)記DNA3’隱蔽末端③更有效地補(bǔ)平末端第85頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一6.逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質(zhì)由和兩條多肽鏈組成。第86頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一①鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和RNaseH活性。RNaseH：鏈經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以5’3’或3’5’方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA第87頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途②鏈RNA-DNA雜交雙鏈中5’3’DNA外切酶活性。①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。AAAAATTTTT5’3’mRNA5’cDNA第88頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一②合成DNA探針用隨機(jī)引物（randomprimer）或oligodT做引物。隨機(jī)引物：隨機(jī)順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合）③RT-PCR用的模板克隆某個(gè)基因時(shí)，用其mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。第89頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個(gè)亞基。3.特性（1）5’3’DNA聚合酶活性（terminaltransferase）第90頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一②不需要模板?、傩枰?’—OH、二甲胂酸緩沖液。③底物可以是單鏈DNA、是3’—OH突出的雙鏈DNA、

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④隨機(jī)添加的dNTPs。如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA5’3’TTTdTTP，末端轉(zhuǎn)移酶第91頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一4.末端轉(zhuǎn)移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉(zhuǎn)移酶第92頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（2）再生酶切位點(diǎn)便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補(bǔ)平第93頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源DNA第94頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（3）非放射性標(biāo)記DNA片斷的3’端AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點(diǎn)HindⅢ位點(diǎn)連接催化非放射性標(biāo)記物參入DNA片斷的3’端。（生物素-11-dUTP等）第95頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一二、T4多核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2.功能催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否。第96頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的磷酸帶有32P標(biāo)記，就會(huì)被轉(zhuǎn)移到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。第97頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP多核苷酸激酶3’P--OH5’3’HO--P5’堿性磷酸酶（1）正向反應(yīng)（forwardreaction）第98頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一（2）交換反應(yīng)標(biāo)記法反應(yīng)混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP時(shí)，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應(yīng)效果不理想。第99頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一

三、堿性磷酸酶1.堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細(xì)菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。SDS中加熱68oC可完全失活。第100頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一2.堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶3.堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體份子自我連接第101頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’5’5’第102頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。第103頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一ATTCGAAGCTTAAGCTTAATTCGA連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個(gè)nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù)。3’P-AGCTTA-OH5’3’HO-ATTCGA-P5’外源DNA9第104頁，共116頁，2023年，2月20日，星期一第五節(jié)核酸外切酶（Exonucleases）是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解核苷酸的酶。一、單鏈DNA外切酶1.大腸桿菌核酸外切酶I