第六章花藥與花粉培養(yǎng)

第六章花藥與花粉培養(yǎng)第1頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)概述圖8.1花藥（A）和花粉（P）培養(yǎng)的雄核發(fā)育和單倍體植株的各種方式圖解第2頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)小孢子的形成和花粉的發(fā)育途徑一、小孢子的正常發(fā)育二、花藥培養(yǎng)時花粉發(fā)育途徑1營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑（A型）2生殖細(xì)胞發(fā)育途徑3營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑4花粉均等分裂途徑第3頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一一、小孢子的正常發(fā)育第一期:四分孢子形成期第二期:單核期特點(diǎn)：特化的細(xì)胞壁逐漸形成。可分為：單核早、中、晚（靠邊）第三期：雙核期第四期：三核期第4頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一二、花藥培養(yǎng)時花粉發(fā)育途徑1、營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑（A型）花粉

生殖核（?。?-----不分裂或分裂幾次后退化營養(yǎng)核（大）-----經(jīng)多次分裂而形成多細(xì)胞團(tuán)，并迅速增殖而突破花粉壁，細(xì)胞持續(xù)分裂形成類胚體或愈傷組織，最后形成單倍體植株常見的植物：煙草、大麥、光葉曼陀羅、小麥、小黑麥和辣椒第5頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一2、生殖細(xì)胞發(fā)育途徑只在天仙子中出現(xiàn)完全不再分裂只分裂有限幾次即停止?fàn)I養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞多次分裂多細(xì)胞團(tuán)發(fā)育愈傷組織胚狀體單倍體植株第6頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一3、營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并進(jìn)發(fā)育途徑營養(yǎng)細(xì)胞多次分裂大的多細(xì)胞團(tuán)生殖細(xì)胞多次分裂小的多細(xì)胞團(tuán)同時發(fā)育愈傷組織胚狀體單倍體植株只見于南洋金花中DNA復(fù)制兩種營養(yǎng)核發(fā)生融合發(fā)育2n、3n或4n胚狀體有兩種情況12第7頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一4、花粉均等分裂途徑這個途徑在南洋金花中相當(dāng)普遍生殖細(xì)胞多次分裂多細(xì)胞團(tuán)發(fā)育愈傷組織胚狀體單倍體植株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞花粉均等分裂營養(yǎng)核生核核第8頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)花藥培養(yǎng)概念：花藥培養(yǎng)（antherculture）：指用無菌操作技術(shù)將成熟或未成熟的花藥接種在人工培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)花粉單性發(fā)育形成植株的過程。第9頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一一、花藥培養(yǎng)的一般操作程序1.培養(yǎng)基的選擇2.材料選取3.材料預(yù)處理4.材料消毒5.接種6.脫分化培養(yǎng)7.再分化培養(yǎng)8.花粉植株移植9.染色體加倍第10頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一1.培養(yǎng)基的選擇NitschH、MS被廣泛用于雙子葉植物的花藥培養(yǎng)。B5：被廣泛用于十字花科及豆科植物的花藥培養(yǎng)。禾谷類植物的花藥培養(yǎng)，早期多采用Miller培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基和馬鈴薯2號培養(yǎng)基。

Sunderland(1984)設(shè)計(jì)了C17培養(yǎng)基，用于水稻、小麥、大麥、小黑麥、黑麥、玉米和甘蔗等禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。第11頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一2.材料選取植物種減數(shù)分裂中期減數(shù)分裂晚前期四分體單核期雙核期成熟期水稻小麥玉米油菜大麥番茄茄子辣椒擬南芥菜甘藍(lán)蘋果葡萄煙草小黑麥小黑麥×羊茅楊樹00000000000000000000不同植物花藥培養(yǎng)的合適花粉發(fā)育時期第12頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一3.材料預(yù)處理低溫：高溫生長素其他方法處理常能提高愈傷組織和苗分化的頻率。第13頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一4.材料消毒取回的材料，在接種前進(jìn)行表面滅菌，一般用70～75％酒精，將表面擦洗即可。第14頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一5.接種在無菌接種室或超凈工作臺上進(jìn)行接種操作，采用直徑3cm的試管，每管接種花藥30～60粒。必須注意：在操作過程中，不應(yīng)使花藥受到損傷，因?yàn)閾p傷常常會刺激花藥壁形成二倍體的愈傷組織。損傷的花藥要淘汰。第15頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一6.脫分化培養(yǎng)根據(jù)材料不同，選取適宜的基本培養(yǎng)基、適當(dāng)?shù)纳L素比例和最適的溫度進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)10～30天可誘導(dǎo)愈傷組織形成。第16頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一7.再分化培養(yǎng)愈傷組織增殖到1～3mm大小時，應(yīng)及時進(jìn)行再分化培養(yǎng)以獲得花粉植株。要選擇含適當(dāng)激素水平的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，約經(jīng)20～30天就能誘導(dǎo)苗的分化。第17頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一8.花粉植株移植當(dāng)花粉植株的根系生長良好時，就要及時進(jìn)行煉苗并移至苗床或大田。試管中花粉植株的移植是一個由異養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)的過程，必須細(xì)心管理，保持幼苗的水分平衡和促進(jìn)新根的發(fā)生。第18頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一9.染色體加倍人工方法：用0.02～0.4%秋水仙素處理植株，雙子葉植物處理生長點(diǎn)或腋芽，禾本科植物在分蘗期處理。單倍體植株可以通過自發(fā)的核內(nèi)有絲分裂產(chǎn)生的二倍體。第19頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一第20頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一二、花藥培養(yǎng)的方法瓊脂固體培養(yǎng)法在培養(yǎng)基中加入0.5～0.7%瓊脂，使培養(yǎng)基呈半固體狀態(tài)。加入的瓊脂量因瓊脂質(zhì)量而定。瓊脂濃度一般以花藥有1/3浸入而又不沉沒于瓊脂中為宜。液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基厚約0.5cm,若能讓花藥漂浮在液面上,效果最好。加入聚蔗糖(Ficoll),可使花藥不下沉而漂浮在液面上。第21頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)花粉培養(yǎng)

含義：花粉培養(yǎng)(pollenculture)是指把花粉從花藥中剝離出來，在無菌的人工環(huán)境中，以單個花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)使其進(jìn)一步生長發(fā)育的技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：在于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的小植株都是單倍體植株，不會因藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織的干擾而形成體細(xì)胞植株。花粉是研究細(xì)胞分化條件、胚胎發(fā)生和形態(tài)發(fā)生機(jī)制的較為理想的材料。建立花粉培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)也可為深入開展細(xì)胞工程、遺傳工程和分子生物學(xué)的研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。第22頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一一、花粉培養(yǎng)的一般操作程序花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)的一般操作程序基本相同?；ǚ叟囵B(yǎng)在材料消毒后要將花粉從花藥中分離出來，再進(jìn)行接種，其基本操作程序可參照花藥培養(yǎng)。第23頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一二、花粉的分離方法自然散落法把花藥從未開的花中在無菌條件下取出，直接插接在無菌培養(yǎng)基上，當(dāng)花藥自動裂開時，花粉散落在培養(yǎng)基上，移走花藥，讓花粉繼續(xù)培養(yǎng)生長。如果是液體培養(yǎng)基，可接種大量花藥，經(jīng)1～2天，大量花粉散落入培養(yǎng)基中，經(jīng)離心濃縮收集，再接種培養(yǎng)。機(jī)械擠壓法優(yōu)點(diǎn)：操作簡便缺點(diǎn)：花粉中混雜有體細(xì)胞并且所得的懸浮液中花粉密度也不易控制。第24頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一三、花粉培養(yǎng)的方法直接培養(yǎng)法從未經(jīng)任何預(yù)培養(yǎng)或預(yù)處理的新鮮花藥中分離花粉粒，直接接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法為直接培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)法將花藥在基本培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3～6天，然后取出花粉，經(jīng)離心沖洗后，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，密度為105個/ml。培養(yǎng)三周后，可見到各個階段的花粉胚；4～5周后，可發(fā)育成小植株。看護(hù)培養(yǎng)法先把植物的完整花藥放在半固體瓊脂培養(yǎng)基表面，然后在花藥上覆蓋一張濾紙小圓片，用移液管吸取0.5ml花粉懸浮液，密度是每毫升含有20個花粉粒，滴在濾紙圓片上，置于26℃下培養(yǎng)。條件培養(yǎng)法在合成培養(yǎng)基中加入失活的花藥提取物，然后接入花粉進(jìn)行培養(yǎng)。由于失活的花藥提取物中含有促進(jìn)花粉發(fā)育的物質(zhì)，有利于花粉培養(yǎng)成功。添加花藥提取物的濃度隨植物的種類而異。哺養(yǎng)培養(yǎng)微室培養(yǎng)將花粉粒接種在蓋玻片或載玻片制作的一個微室的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。第25頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一四、影響花藥和花粉培養(yǎng)的因素材料的基因型供體植株的生活環(huán)境個體發(fā)育的時期：開花早期的花藥比開花后期的更易產(chǎn)生花粉植株離體花藥預(yù)處理低溫預(yù)處理：預(yù)處理溫度一般最低為2℃，最高為14℃，處理時間短的僅6小時，長的達(dá)35天，高溫處理其他處理：低溫、高溫、高滲、飽和水汽、離心磁場、Y射線、pH、CO2、ABA、丁酸鈉、放線菌素D，甲基磺酸乙酯培養(yǎng)基成分基本培養(yǎng)基成分：主要是MS、N6，Blaydes(即Miller)，B5、Nitsch。植物激素生長素，如2,4-D、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）等，細(xì)胞分裂素如激動素（6-呋喃氨基嘌呤、KT、K2N）、6-BA（6-芐基氨基嘌呤）和玉米（ZT、ZEA）糖：在花藥培養(yǎng)中，其蔗糖濃度一般以2～5%為宜。麥芽糖更佳。pH：當(dāng)pH值達(dá)到5.8時，效果最好。第26頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一不同濃度蔗糖對煙草花藥出苗率的影響蔗糖（%）接種花藥數(shù)出苗花藥數(shù)出苗率019001711723.932532037.733642539.064791417.72第27頁，共29頁，2023年，2月20日，星期一第五節(jié)花藥與花粉培養(yǎng)的應(yīng)用及前景一、花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用首先，花藥培養(yǎng)可用于常規(guī)育種從品種間雜交的雜種一代或二代、三代的花藥可培育出純合二倍體花粉植株，用于品種的選擇和鑒定。在這種情況下常規(guī)育種所必需的多代自交的程序可以被省去，育種的時間也可大大縮短，這種方法也可以稱為單倍體育種。其次，來源于花粉的純合二倍體可以作為自交系用于異花傳粉植物的