DB1308T 321-2023 春季蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術規(guī)程

S52.0CCSB05

DB1308承 德 市 地 方 標 準B108T21023春季蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術規(guī)程2023-02-25發(fā)布 2023-03-01實施承德市市場監(jiān)督管理局 發(fā)布B108T21023前 言本文件按照GT.-200《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由承德市農業(yè)農村局歸口。本文件起草單位:承德市蔬菜技術推廣站、圍場滿族蒙古族自治縣蔬菜環(huán)保站、興隆縣工商業(yè)聯(lián)合會。本文件主要起草人：王玉宏、鄭鵬婧、姜紅玉、姜濤、李兵、劉博、王春紅、劉斯超、唐麗麗、卞穎。I春季蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術規(guī)程范圍本文件適用于春季蘿卜游離小孢子培養(yǎng)，十字花科蔬菜游離小孢子的培養(yǎng)可參照執(zhí)行。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GT62 3.1游離小孢子不形成配子的游離狀的單核細胞。3.2游離小孢子培養(yǎng)培養(yǎng)條件實驗室環(huán)境整潔，干凈衛(wèi)生，有溫度調節(jié)設備，室內溫度控制在20℃～27℃。試劑或材料培養(yǎng)用水符合GB/T6682中規(guī)定的三級水，除非另有規(guī)定，在培養(yǎng)過程中僅使用分析純試劑，試劑或材料包括：B5（含維生素）；NLN（不含維生素）；) 0.0%；蔗糖；瓊脂；萘乙酸；1還原型谷胱甘肽，純度≥99%；L-谷氨酰胺，純度≥99%；L-絲氨酸，純度≥99%；一水嗎啉乙磺酸，純度>99%；乙醇溶液，75%；次氯酸鈉溶液，5%；硝酸鈣溶液，25%；.3%；g00l；00.1g.25g6.0251.025g.02g、D-生物素.00500l。儀器設備與器具儀器設備超凈工作臺；立式壓力蒸汽滅菌器：壓力0.25MPa，溫度139℃；生化培養(yǎng)箱；酸堿度測試儀；電子天平：最大稱量：220g，實際分度值：0.0001g；000rin00bar；ngr-pump1r～00r；流式細胞儀。器具0l；00l；研缽：6cm；0l；古式漏斗：3.5cm×12cm；00l；一次性培養(yǎng)皿：60mm；石蠟封口膜：4cm×125cm；眼科鑷子：10cm；手術刀；3號；長柄鑷子：15cm。操作流程培養(yǎng)基配置→超凈工作臺操作→環(huán)境培養(yǎng)→小孢子植株移栽→留種。2操作方法培養(yǎng)基配置B5B5（含維生素0.1g130g1L，H值調至.800l200n4℃保存。B5B5（含維生素0.1g30g7.5定容到1H值調至.800l0l20熱滅菌0n℃保存。2LN培養(yǎng)基NN（）.3872l000l、0.1g0.03g、L0.8g、L0.1g130g0.63961pH5.8.2mngr-pump0.22μm4℃保存。超凈工作臺操作設備消毒將0l0l20℃滅菌0in超凈工作臺內用5%乙醇全面擦拭一遍。將離心機、酒精燈、0l燒杯、0l試管、研缽、古式漏5/NLN0m0in。準備花蕾1d～32.5mm～3mm0in花蕾消毒先將沖洗干凈的花蕾用乙醇表面消毒30s，期間搖動燒杯，燒杯間不要碰撞。然后使用次氯酸鈉深度消毒5in使用無菌水清洗5in，期間搖動燒杯，充分清洗，此步驟重復操作3次，燒杯間不要碰撞，完成清洗后用乙醇擦拭臺面。研磨花蕾將消毒過的花蕾放于研缽中，倒入B5液體培養(yǎng)基，液面高出花蕾即可，輕敲研缽，使所有花蕾破裂，花粉釋放出即可，加入B5液體培養(yǎng)基定容到10ml。3花蕾液過濾將研磨好的0l花蕾液倒入古式漏斗，經00目紗網過濾后，移至0l離心管，使用離心機000rmn離心3in，倒掉上清液，倒入1l50l，經3次反復操作后，倒掉上清液，得到純凈的花粉母細胞液。分裝1l改良2NN0l0個0m5l改良2NLN1l超凈工作臺注意事項環(huán)境培養(yǎng)現(xiàn)胚培養(yǎng)將分裝好的培養(yǎng)皿放入生化培養(yǎng)箱中，33℃避光熱激24h，后調至25℃避光培養(yǎng)2～3周，即可現(xiàn)胚。再生培養(yǎng)在超凈工作臺環(huán)境下，用眼科鑷子將子葉型胚接種至B5固體培養(yǎng)基上。接種后在25℃自然光下培養(yǎng)，三周后子葉型胚發(fā)育成幼苗。復壯培養(yǎng)在超凈工作臺環(huán)境下，取出幼苗，手術刀去除葉片和根區(qū)，長柄鑷子將剩余組織接種到新的B5固53～.1m～.2m小孢子植株移栽5d～74℃～5℃低10d～20d3周后統(tǒng)計成活率，當苗長到4葉1心時達到成苗標準，即可移栽定植。留種檔案管