流式細胞術原理及應用新

流式細胞術原理及應用新第1頁/共81頁流式細胞術的原理及其應用

第2頁/共81頁第3頁/共81頁FLOWCYTOMETRY

流式細胞術FLOWCYTOMETOR流式細胞儀第4頁/共81頁FlowCytometryMeasuringpropertiesofcellsinflowFlowSortingSorting(separating)cellsbasedonpropertiesmeasuredinflowAlsocalledFluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)第5頁/共81頁分為三大類：第一類－－臺式機

光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動化程度高，操作簡便，易學易掌握,適合用于臨床第二類－－大型機

科研型，分辨率高，可分選用于培養(yǎng)，可選配多種激光器，更靈活第三類－－新型流式細胞儀

裝配有2～4根激光管，同時檢測15個參數(shù)，高速分選達50000個/s第6頁/共81頁第7頁/共81頁第8頁/共81頁第9頁/共81頁第10頁/共81頁流式細胞儀的主要組成部分：光路系統(tǒng)鞘液系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)換及放大系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第11頁/共81頁流式細胞術是20世紀70年代發(fā)展起來的一種技術，有人將流式細胞儀比喻成高級的熒光顯微鏡。目前，該技術以廣泛用于生物及醫(yī)學基礎研究與臨床檢測，在分子生物學、免疫學、遺傳學、血液學、腫瘤學等領域內(nèi)發(fā)揮著重要作用。第12頁/共81頁

流式細胞儀熒光顯微鏡控制電腦人腦光源激光紫外光標本制備成的單細胞（或顆粒）懸液放于固定的標本臺上效率高幾百~幾萬個細胞/秒低幾十個細胞/分結果精確、客觀有主觀因素功能可同時測多個參數(shù)、能進行分選一般只測一個參數(shù)、不能分選第13頁/共81頁鞘液系統(tǒng)流動室第14頁/共81頁第15頁/共81頁光路系統(tǒng)檢測區(qū)第16頁/共81頁第17頁/共81頁第18頁/共81頁第19頁/共81頁第20頁/共81頁第21頁/共81頁光學原理laser第22頁/共81頁第23頁/共81頁第24頁/共81頁第25頁/共81頁抗體標記的方法第26頁/共81頁抗體的選擇首選直接標記抗體熒光分子

PE最強，適用于弱表達抗原

FITC最便宜，適用于強表達抗原間接標記

適用范圍廣,biotin-avidin不適合弱抗原的檢測第27頁/共81頁數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第28頁/共81頁流式細胞分析的信息Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1-FITCFL2-PEFL3-PerCPPL4-APC第29頁/共81頁流式細胞的基本信息:“形態(tài)”第30頁/共81頁流式細胞的主要信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的標記方法是熒光素分子標記的抗體與細胞抗原結合第31頁/共81頁Gating

常用術語第32頁/共81頁流式常見圖形

(Histogram

Plot)直方圖適用于：單參數(shù)分析第33頁/共81頁流式常見圖形

(DotPlot)散點圖適用于：多參數(shù)分析第34頁/共81頁流式應用常見范圍細胞大小細胞的顆粒度細胞表面分子：CD系列細胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細胞因子細胞核內(nèi)分子：P53細胞功能檢測：細胞周期、凋亡其他（膜電位、鈣離子濃度、核酸等）第35頁/共81頁實驗對照的設計空白對照：ALL陰性對照：常用同型抗體對照單色分析：設同型抗體對照多色分析：同型對照，單陽性對照

（用于儀器校正）陽性對照：檢測陰性時第36頁/共81頁實驗標本的處理單細胞懸液的制備：

物理法（剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨粉）

化學法（酶消化）抗體或標記分子的染色：抗原抗體反應非特異結合的去除：洗滌和封閉

封閉－－血清和同型抗體第37頁/共81頁可用流式細胞儀分析的標本外周血、骨髓、癌組織、癌旁組織、石蠟切片、各種體液（尿、腦脊液、胸腹水等）

必需制備成單細胞懸液單細胞生物、特殊處理的植物細胞、某些非細胞粒子、可溶性分子第38頁/共81頁

待測標本處理成單event懸液熒光素標記的單抗染色鞘液經(jīng)處理的細胞單個通過激光聚焦區(qū)檢測散射光、熒光

信號轉(zhuǎn)化、放大

計算機數(shù)據(jù)處理分選第39頁/共81頁SORTING（細胞分選）分選速度分選純度分選收獲率第40頁/共81頁第41頁/共81頁流式細胞術的應用

細胞死亡分兩種：凋亡和壞死細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用；它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。細胞發(fā)生凋亡時，就像樹葉或花的自然凋落一樣，借用希臘“Apoptosis”來表示，意思是像樹葉或花的自然凋落，可譯為細胞凋亡。

（一）凋亡的檢測第42頁/共81頁細胞凋亡與壞死的區(qū)別

雖然凋亡與壞死的最終結果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。

壞死（necrosis）：壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細胞脹大，胞膜破裂，細胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應。

凋亡是細胞對環(huán)境的生理性、病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應答有序變化的死亡過程。其細胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。

第43頁/共81頁細胞凋亡的生物學意義胚胎形成、肌體正常發(fā)育、衰老和損傷細胞的清除以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等都與細胞凋亡有關。生物醫(yī)學的研究熱點第44頁/共81頁凋亡檢測

每一步都有檢測試劑盒每一步都有檢測試劑盒第45頁/共81頁1、半胱氨酸蛋白酶3檢測法（早早期）2、AnnexinV-FITC/PI法（早期）3、Apo2.7檢測法（早期）4、TUNEL法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、細胞凋亡相關基因的流式細胞術檢測流式細胞術檢測細胞凋亡第46頁/共81頁

亞二倍體峰（凋亡峰）

---PIstaining

不能區(qū)分凋亡與死亡細胞第47頁/共81頁AnnexinVAssay

建議用于懸浮細胞第48頁/共81頁AnnexinVAssay

能夠區(qū)分死亡與凋亡

第49頁/共81頁第50頁/共81頁細胞周期G1MG2SQuiescentcellsG0第51頁/共81頁（二）定量流式細胞術（quantitativeflowcytomety)

通過檢測標準微球的熒光強度獲得標準曲線，通過標準曲線求得待測細胞的某種生物分子的精確數(shù)值，從而反映在某種生理病理條件下出現(xiàn)的微細變化，對臨床疾病的研究、診斷及治療等具有重要意義。第52頁/共81頁微球流式芯片技術

CBA(CytometricBeadArray)采用夾心法分析策略,以微珠來捕獲可溶性分子。第53頁/共81頁（三）流式細胞術的臨床應用白血病免疫分型HLA-B27:強直性脊柱炎淋巴細胞亞群造血干細胞計數(shù)：造血干細胞移植網(wǎng)織紅細胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗第54頁/共81頁流式細胞術與造血干細胞移植第55頁/共81頁流式細胞術與白血病免疫分型第56頁/共81頁流式細胞的免疫分型：是白血病分型的重要指標，而白血病分類是選擇化療方案和判斷預后的重要依據(jù)。

FAB標準(MICM)，形態(tài)學、免疫表型染色體、分子生物學結合,適合于白血病的分型診斷，但不適合用于確診是不是白血病。Minimalresidualdiseases(MRD)第57頁/共81頁微小殘留病變的檢出（MRD）：

MRD是白血病復發(fā)的主要根源，F(xiàn)CM的高特異性和敏感性可以在患者緩解期檢測是否有殘留病變細胞，早期探測MRD，以免復發(fā)。第58頁/共81頁有證據(jù)表明外周血淋巴細胞HLA-B27的表達及其表達程度與強直性脊髓炎的發(fā)生有很大相關性，利用流式細胞術進行HLA-B27檢測，可同時排除交叉反應，是目前檢測HLA-B27的最好方法。流式細胞術與強直性脊柱炎第59頁/共81頁第60頁/共81頁淋巴細胞亞群分析

機體免疫狀態(tài)是衡量機體是否罹患疾病的重要指標，目前多采用流式細胞術來檢測機體的免疫狀態(tài)，其中最重要的指標是檢測T,B,NK淋巴細胞的水平。第61頁/共81頁常用細胞表型及意義（clusterofdifferentiation,CD)CD3總T細胞CD4T輔助/誘導細胞亞群CD8T抑制/細胞毒細胞亞群CD19B細胞抗原CD16+56NK細胞CD33髓細胞前體CD34多能干細胞第62頁/共81頁由于T淋巴細胞在人體的免系統(tǒng)中承擔著重要功能，因此當感染發(fā)生時，T淋巴細胞各亞群的變化往往能很敏感地反應感染的狀態(tài)和程度。例如：CD4分子有HIV識別部位，因CD4細胞是HIV病毒的受體，AIDS患者CD4+T細胞明顯減少，該指標是診斷AIDS的重要指標。當病毒感染發(fā)生時（如乙型肝炎、EB病毒和巨細胞病毒包涵體病毒），CD8+T細胞增多，對CD8T細胞測定有助于對感染的診斷、治療效果的動態(tài)觀察。第63頁/共81頁利用流式細胞儀可對器官移植和骨髓移植后的患者進行監(jiān)控。當患者CD3+、CD25+持續(xù)增加提示已開始發(fā)生排異，CD4+/CD8+

T持續(xù)下降，表明有感染發(fā)生，當其比值小于0.2時必需停用免疫抑制劑。

流式細胞術與移植第64頁/共81頁其它免疫性疾病分析

SLE患者的淋巴細胞變化可以反應該病的活動情況和器官侵犯程度，活動或非活動性伴有多系統(tǒng)疾病，但無腎臟損害的患者可出現(xiàn)CD4+CD8+T比值升高，伴有嚴重腎臟損害的SLE患者可出現(xiàn)低CD4+、高CD8+的現(xiàn)象。第65頁/共81頁流式細胞術與PNH利用流式細胞術檢測陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH），根據(jù)血細胞的細胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂（GPI）所連接的蛋白，如DAF（CD55）與MIRI（CD59），來確診此病，比傳統(tǒng)的血清溶血試驗具有更高的特異性與敏感性。第66頁/共81頁第67頁/共81頁第68頁/共81頁血小板：巨血小板血小板無力癥

網(wǎng)織血小板流式細胞術與血小板第69頁/共81頁血栓性疾與血栓前狀態(tài)：

由于活化血小板是血栓的主要成分之一，也是引起血栓形成的主要原因，所以血小板活化程度的增高與疾病的發(fā)生發(fā)展有關。第70頁/共81頁流式細胞術與網(wǎng)織紅細胞第71頁/共81頁

DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是惡變細胞的重要標志，F(xiàn)CM在腫瘤學上的應用，主要是利用DNA含量測定，進行癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導以及預后評估等工作。

癌前病變的癌變率與病變的增生程度一致，而增生程度與DNA含量的異常改變又呈平行關系。

流式細胞術與腫瘤第72頁/共81頁

FCM通過精確定量DNA含量，能對癌前病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢作出判斷，有助于癌前病變的早期診斷。

DNA倍體分析有助于臨界性腫瘤的診斷，如卵巢交界性腫瘤，異倍體的出現(xiàn)與病變的惡性發(fā)展有關。第73頁/共81頁

DNA異倍體、高S期細胞比值和高增殖細胞核抗原（PCNA）表達與細胞增殖能力、惡性程度和不良預后呈正相關。第74頁/共81頁為治療方案和藥理學研究提供依據(jù)：不同類型的腫瘤對化療藥物的敏感性不同?？衫肍CM進行細胞周期分析，適當選擇周期特異性藥物或非周期特異性藥物。