第十免疫學(xué)檢測技術(shù)

第十免疫學(xué)檢測技術(shù)第1頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二利用免疫學(xué)原理建立的檢測技術(shù)，主要應(yīng)用于對多種免疫性疾?。ǜ腥拘约膊?、免疫缺陷病、超敏反應(yīng)、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反應(yīng)和腫瘤等）的診斷、療效評估、發(fā)病機(jī)制探討、以及對抗原性物質(zhì)或免疫細(xì)胞的定性、定量，對細(xì)胞因子、粘附分子及細(xì)胞受體的檢測等。第2頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)抗原或抗體的檢測抗原-抗體直接反應(yīng)包括沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、溶解反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和中和反應(yīng)等?？乖?抗體反應(yīng)可用已知的特異性抗體檢測未知的抗原；也可用已知的抗原檢測未知的抗體。免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)、發(fā)光免疫分析等免疫標(biāo)記技術(shù)提高了抗原抗體反應(yīng)的敏感性。第3頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1.抗原-抗體的結(jié)合是特異性結(jié)合2.抗原抗體結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合3.抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段特異性結(jié)合階段可見的反應(yīng)階段4.抗原和抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象，于兩者的分子比例密切相關(guān)第4頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二抗原抗體比例對反應(yīng)現(xiàn)象的影響第5頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二抗原-抗體反應(yīng)受多種因素影響1電解質(zhì)：抗原-抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉作為稀釋液，以供給適應(yīng)濃度的電解質(zhì)。2溫度：一般常使用反應(yīng)在37度水浴或孵育箱中進(jìn)行。3.酸堿度：抗原-抗體反應(yīng)適應(yīng)的酸堿度

為PH6~8。第6頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二抗原抗體的檢測方法凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體溶血反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)中和反應(yīng)用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)第7頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二凝集反應(yīng)

(Agglutination)細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集現(xiàn)象，稱為凝聚反應(yīng)。1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。

2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。第8頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二血球凝集第9頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二沉淀反應(yīng)

（Precipitation)

血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物，這一類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，如絮狀沉淀。大多沉淀反應(yīng)是用半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散故也稱免疫擴(kuò)散。第10頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二單向免疫擴(kuò)散

(SingleImmunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖跀U(kuò)散過程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)第11頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二雙向免疫擴(kuò)散

（DoubleImmunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測。第12頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)是先將待側(cè)血清標(biāo)本作瓊脂凝膠電泳，血清中各蛋白組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應(yīng)的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴(kuò)散，在各區(qū)帶相應(yīng)的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。第13頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二火箭電泳（RocketElectrophoresis)

火箭電泳，是把單向免疫擴(kuò)散同電泳結(jié)合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動，兩者比例適宜時(shí)，在較短時(shí)間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。此法的特點(diǎn)是需時(shí)較短，故可用于快速沉淀標(biāo)本中抗原的含量。第14頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二火箭電泳示意圖第15頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)（ComplementFixation,CFT)

敏感性和特異性均較高，但該試驗(yàn)影響因素較多，現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢。第16頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二免疫標(biāo)記技術(shù)用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。標(biāo)記物質(zhì)與抗體（或抗原）的化學(xué)連接未改變抗體（或抗原）的免疫學(xué)特性，同時(shí)標(biāo)記物的性質(zhì)依然存在，因而極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測。

免疫標(biāo)記技術(shù)主要有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)。第17頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二免疫熒光顯微技術(shù)

(ImmunofluorescenceTechnique)用熒光素（常用的有異硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC)與抗體連接成熒光抗體，再與待測標(biāo)本的抗原反應(yīng)，，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借此對標(biāo)本中的抗原作鑒定和定位。包括直接熒光法、間接熒光法和補(bǔ)體法。第18頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二直接熒光法

將熒光素直接標(biāo)記抗體作標(biāo)本染色。該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，但其缺點(diǎn)是每檢測一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。第19頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二間接熒光法（indirectimmunofluorescenceassay，IFA）

用一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗染色。該法的優(yōu)點(diǎn)是敏感性比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗可用于多種抗原的檢測，但非特異性熒光亦會增加。第20頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二間接免疫熒光法示意圖第21頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二補(bǔ)體結(jié)合免疫熒光法此法是在間接法的第一步抗原—抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體，使之與抗原——抗體復(fù)合物結(jié)合；再用熒光素標(biāo)記的抗C3抗體進(jìn)行示蹤。第22頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二免疫熒光顯微技術(shù)第23頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM)FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。FCM還可對同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析，為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項(xiàng)新技術(shù)。第24頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二流式細(xì)胞儀工作原理第25頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二酶免疫測定

(EnzymeImmunoassay,EIA)用酶（常用的有辣根過氧化物酶，HRP和堿性磷酸酶，AP)標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。EIA將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過酶作用于底物后顯色來判定結(jié)果。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和酶免疫組化法，前者測定可溶性抗原或抗體，后者測定組織中或細(xì)胞表面的抗原。第26頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。用洗滌法將液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾心法、間接法BAS-ELISA等。第27頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二ELISA檢測抗體第28頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二第29頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二放射免疫測定法

(Radioimmunoassay,RIA)用放射性核素標(biāo)記抗原進(jìn)行的免疫學(xué)檢測技術(shù)。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使檢測的敏感性達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質(zhì)的測定。第30頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二

Ag*AbAg

標(biāo)記抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量測定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性放射免疫測定法(RIA)示意圖第31頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線

7550301001101001000未標(biāo)記抗原濃度（ng/ml)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）第32頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二免疫印跡法(Immunoblotting)將凝膠電泳與固相免疫測定結(jié)合，先把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測定。該法能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量。常用于檢測多種病毒如HIV的抗體或抗原。第33頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二免疫印跡法示意圖第34頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二二淋巴細(xì)胞的測定檢測各群體淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能是觀察機(jī)體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標(biāo)本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標(biāo)本進(jìn)行檢查。第35頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上第36頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二一）淋巴細(xì)胞類型和數(shù)目的測定1、花結(jié)試驗(yàn)：E花結(jié)試驗(yàn)可用于檢測T細(xì)胞數(shù)目。EA花結(jié)試驗(yàn)可用于檢測B細(xì)胞數(shù)目。2、免疫熒光法：常采用間接免疫熒光法。3、流式細(xì)胞術(shù)：借助流式細(xì)胞儀（FCM)。第37頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二花結(jié)試驗(yàn)示意圖第38頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二T細(xì)胞功能測定體外法：T細(xì)胞增殖試驗(yàn)形態(tài)學(xué)檢查

3H-TdR摻入法

MTT法體內(nèi)法：用生物抗原或化學(xué)抗原作皮內(nèi)試驗(yàn)。OT-PPD(結(jié)核菌素試驗(yàn))皮試SD-SK(鏈球菌DNA酶-鏈激酶

)皮試

第39頁，共42頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞全血分層液離心過濾測量放射性淋巴細(xì)胞增