過程參數(shù)檢測(工程碩士)-緒論補充

2012年過程參數(shù)檢測(工程碩士)——緒論補充第一頁，共79頁。2.1生物反應器過程的多尺度效應與工程學原理

2.1.1生物反應過程多尺度系統(tǒng)

2.1.2生物反應器中多尺度結構系統(tǒng)特點

2.1.3跨尺度觀察與控制

2.2細胞代謝流分析為核心的發(fā)酵工程關鍵技術

2.3方法和裝備技術研究

2.4應用與結果第二頁，共79頁。2.1生物反應器過程的多尺度效應與工程學原理第三頁，共79頁。發(fā)酵工程在國民經濟發(fā)展中的作用發(fā)酵工程的新內涵──生物技術發(fā)展與產業(yè)化食品：新型食品添加劑、防腐劑、功能食品基因工程產品：新藥、抗體疫苗、酶生物基化工產品：可降解塑料、1,3丙二醇、生物乙烯生物能源:

纖維素乙醇、生物柴油環(huán)境保護：利用生物法治理環(huán)境污染農業(yè)發(fā)展環(huán)境：飼料、農副產品深加工、生物肥料、土壤改造、農藥發(fā)酵工程產品涉及眾多行業(yè)領域：輕工(食品)、醫(yī)藥(發(fā)酵類）化工、農業(yè)、環(huán)保、能源等第四頁，共79頁。技術發(fā)展中面臨的主要問題存在問題：優(yōu)化與放大技術效率低（10-30%），周期長（月、年）優(yōu)化與放大困難：傳感器提供了大量生物學信息全局動態(tài)優(yōu)化與放大困難基因、轉錄、表達、代謝途徑…溫度、攪拌、pH、DO、培養(yǎng)基配方…

對于活體細胞調控來說，采用傳統(tǒng)的生物學方法或化學工程的調控方法，存在很大的問題，國內外都沒有很好解決。第五頁，共79頁。2.1.1.微生物發(fā)酵過程復雜系統(tǒng)多尺度參數(shù)相關分析機制與理論上萬個基因，上千個代謝物和反應器的混合傳遞基因網絡、細胞代謝網路、反應器網絡（不同的空間尺度和時間尺度）不是簡單的統(tǒng)計熱力學關系網絡間的多輸入多輸出關系──物質流、能量流、信息流生命屬性所特有的時空串聯(lián)反應關系第六頁，共79頁。不同尺度的網絡狀態(tài)關系第七頁，共79頁。參數(shù)相關分析與跨尺度測量每個尺度網絡通過網絡間的輸入輸出，形成對復雜系統(tǒng)總體的影響，表現(xiàn)在不同尺度參數(shù)相關實現(xiàn)發(fā)酵過程中與基因、細胞、反應器多尺度變化相關的宏觀細胞代謝流和反應器物質流參數(shù)檢測發(fā)酵過程海量的數(shù)據(jù)處理：軟件包與模型的建立尋找過程敏感參數(shù)，通過對敏感參數(shù)的優(yōu)化調整實現(xiàn)跨尺度的優(yōu)化,找到發(fā)酵過程優(yōu)化或放大關鍵問題第八頁，共79頁。發(fā)酵過程優(yōu)化和放大研究中的科學問題長期來，對于微生物過程優(yōu)化的研究只是停留在細胞外的反應器過程可操作因素的研究，雖然也有化學工程的學科原理，但局限性很大。隨著分子生物學的發(fā)展，但是由于單一生理調控機制出發(fā)的研究往往只揭示了生理調控的局部和某一時段的特點，難以對整個發(fā)酵過程優(yōu)化控制和放大起決定性作用。

如何把生物學與工程學相結合，解決局部與整體、時變動態(tài)與最終結果、菌種改造與過程優(yōu)化的關系。第九頁，共79頁。

以各自研究的技術背景從單一尺度去理解和分析研究發(fā)酵過程特點第十頁，共79頁。菌種選育或基因構的研究人員對分子尺度的DNA變化有深刻的理解研究各種菌種突變和篩選方法采用編碼生物合成途徑中關鍵酶基因質粒轉移或改造來改良生產菌種組合生物合成：微生物的多樣性和次級代謝物的多樣性，以及天然資源中獲得的有意義基因，通過重組、組合或互補形成高生產水平或新結構的化合物的多酶體系基因工程構建：綜合考慮控制轉錄、翻譯、蛋白質穩(wěn)定性及向胞外分泌等諸多方面因素，以及表達載體，宿主系統(tǒng)特性等第十一頁，共79頁。細胞代謝特性研究細胞形態(tài)學細胞生理學代謝途經：以代謝調控為核心的外部環(huán)境條件控制缺乏主動性和目標性，很大部分還停留在經驗摸索水平上代謝工程：采用基因工程重組技術對細胞酶、運輸和調節(jié)功能進行處理來改善細胞代謝途經的技術。擴展細胞代謝途經，得到新的代謝物。強化瓶頸部分的代謝流，達到提高菌株或細胞株的生產水平第十二頁，共79頁。工程化研究操作變量優(yōu)化：通氣、攪拌、補油方式、補料方式狀態(tài)變量優(yōu)化：溫度、DO、pH、溶解CO、氧化還原電位……設備設計：通氣比、攪拌功率、H/D、d/D、攪拌槳形式、裝料系數(shù)、總空氣管距離、滅菌方式……化學工程三傳（動量、質量、熱量）問題研究，放大技術（無因次、時間常數(shù)、數(shù)學模擬、經驗法則）計算流體力學研究第十三頁，共79頁。

空間尺度與時間尺度

基因水平的分子尺度屬于納尺度范圍，一般在10-9M以下

細胞尺度屬于微尺度范圍，在10-8-10-4M之間

反應器尺度屬于介尺度范圍，在10-3-102M之間

第十四頁，共79頁。

-6-4-20246[s]logtime酶濃度變化質量作用變構控制m-RNA控制種群選擇進化微生物和細胞在酶活性水平上（包括酶的激活、抑制、亞基的結合和解離、共價修飾和降解）控制的時間常數(shù)描述在ms至s的范圍內基因表達調控水平上（誘導、阻遏）描述至min細胞內酶的濃度變化與菌體生長由小時至天為單位種群選擇和進化水平上則描述至更大的單位第十五頁，共79頁?；蚪M環(huán)境組轉錄組蛋白組代謝組基因操作過程優(yōu)化TCS調控網絡轉錄調控網絡代謝調控網絡第十六頁，共79頁。2.1.2

微生物反應工程尺度劃分根據(jù)不同的研究要求和相關的學科發(fā)展，可以有不同的劃分以細胞過程為研究對象：分子層次尺度、分子聚集體尺度、細胞細微結構尺度和細胞尺度上進行多尺度系統(tǒng)研究。生物反應器的混和傳遞特性研究：可以將系統(tǒng)分解為單顆粒的微尺度、團聚物的介尺度和設備的宏尺度。揭示生命過程基因信息傳遞規(guī)律：可以使用量子化學的方法從電子和原子核到DNA生物大分子這一尺度跨越研究第十七頁，共79頁。2.2

生物反應器中多尺度結構系統(tǒng)特點第十八頁，共79頁。2.2.1復雜系統(tǒng)多尺度結構的普遍性

“多尺度”的提法最早出現(xiàn)在化學工程學科領域

以“單元操作”和“過程傳遞”為標志的傳統(tǒng)方法已不能滿足這一需求，研究流動、傳遞、分相和反應（范圍小至分子，大至河流、大氣）多尺度行為和同一尺度下這些現(xiàn)象共存的規(guī)律，是當前化學工程定量化的趨勢。

時空多尺度特征是過程工程中所有復雜現(xiàn)象的共同特征。對物質轉化系統(tǒng)進行研究時，如果以某一物質現(xiàn)象的不同尺度作為對象，一旦找出可遵偱的關系，就可能從現(xiàn)象到本質，過程研究與控制將發(fā)生質的變化。

第十九頁，共79頁。復雜系統(tǒng)多尺度結構的普遍性

尺度的因素不僅存在于化工中，美國1999-04-02出版的Science是復雜科學問題的?？?，

“多尺度”的術語已經被廣泛地使用，但不同人所認同的“尺度”的含義可能不相同，往往是每一種尺度的劃分及其尺度間的相關特性都有其某一學科發(fā)展的背景。

第二十頁，共79頁。2.2.2

活細胞為主體生物反應器過程的尺度劃分作為工業(yè)過程研究，應抓住多尺度系統(tǒng)的結構、性能和制備的關系

可以分為基因分子水平的網絡結構、細胞水平的代謝網絡與生物反應器系統(tǒng)的宏觀網絡結構是不同尺度的網絡狀態(tài)微生物代謝流是這一網絡關系的的核心問題。微生物的代謝流處于不斷變化之中，其方向、流量甚至所流經的途徑都可能發(fā)生變化。這就是微生物代謝流的變動性和代謝網絡中途徑的選擇性。

第二十一頁，共79頁。2.2.3

具有“變化著的結構”

當生物反應器尺寸或操作條件變化時，發(fā)生的結果變化不是簡單的用線性關系或平均統(tǒng)計方法所能描述的物質狀態(tài)的變化。導致過程變化的原因除了線性或動力學因素之外，往往還發(fā)生在系統(tǒng)結構性的突變。雖然這種結構性突變從本質上看還是動力學行為，但由于不同尺寸的邊界條件難以區(qū)分，甚至還未能發(fā)現(xiàn)，就造成系統(tǒng)結果的差異或最優(yōu)過程的嚴重偏離。

第二十二頁，共79頁。由于不同尺寸的邊界條件難以區(qū)分，甚至還未能發(fā)現(xiàn)，就造成系統(tǒng)結果的差異或最優(yōu)過程的嚴重偏離

經典的以動力學為基礎的工程學概念系統(tǒng)結構性變化的非線性特征第二十三頁，共79頁。

2.2.4

動態(tài)研究與定態(tài)研究變構效應研究為例：從分子層次尺度上的應答進行研究,當一個小分子作用于變構酶的某些位點時，必然引起一系列后續(xù)變化。由快反應引發(fā)的慢過程，也就是小分子在大分子上的極快的結合引起相對慢的構象變化，有時甚至引起的構象改變通過大分子鏈由近及遠地傳到遠離結合位點的地方這種在極短時間內發(fā)生的事件和極長時間內發(fā)生的事件相互關聯(lián)，使快反應延伸為慢過程，時間跨度大

第二十四頁，共79頁。2.2.5

子尺度分析以化學工程“三傳一反”為基本內容的計算流體力學。對生命過程的認識，包括各種產物的生物合成機制、代謝調控與代射工程功能基因、基因突變與重組技術、RNA調控等，都有系統(tǒng)而深入的研究，并且不斷有新的發(fā)現(xiàn)。這些都為我們研究子過程提供了重要的基礎，必須及時地把有關內容歸納到子尺度研究中。

第二十五頁，共79頁。

2.2.6

跨尺度觀察與操作工業(yè)規(guī)模的生物過程只能在反應器尺度上進行測量與操作可以從低一尺度層次的規(guī)律或性質，來預測研究另一尺度層次的規(guī)律或性質多尺度綜合與各子過程的相互量化關系，澄清不同尺度間相互作用和耦合的原則和條件跨尺度操作是難題，分析跨尺度問題往往需要納入跨學科和跨技術的手段

第二十六頁，共79頁。2.3細胞代謝流分析為核心的發(fā)酵工程關鍵技術第二十七頁，共79頁。2.3.1

網絡狀態(tài)的互動關系

多尺度問題研究為我們研究生物反應器中提供了重要的方法和線索

細胞代謝物質流與生物反應器物料流變化的相關性是研究生物反應器中多尺度關聯(lián)問題的有效方法

第二十八頁，共79頁。

2.3.2細胞代謝物質流與生物反應器物料流變化的相關性生物反應器細胞生長第二十九頁，共79頁。

2.3.2細胞代謝物質流與生物反應器物料流變化的相關性細胞生長Xm(cp)Pco2P細胞水平的代謝動力學SUROURHERH+CERPPR傳統(tǒng)的生物反應器物料流反饋控制

必需高度重視代謝流及其對反應器的影響產物與代謝流有關不同層次反應的關聯(lián)方法(IFB)葡萄糖氮源前體油rpmFH+熱(MVS)SFROTRHTRH+FR反應器混和與傳遞常規(guī)控制器生物反應器sDO剪切TpH(EVs)(PVs)第三十頁，共79頁。(3)數(shù)據(jù)驅動型方法復雜性多容量過程高度非線性動態(tài)性不可預測性線性或擬線性關系的數(shù)學摸型發(fā)酵生產完整過程發(fā)酵過程參數(shù)趨勢曲線相關關鍵技術

數(shù)學模型、靜態(tài)和動態(tài)優(yōu)化、系統(tǒng)識別、自適應控制、專家系統(tǒng)、模糊控制、神經元網絡、各種混沌現(xiàn)象的研究困難跨尺度觀察第三十一頁，共79頁。2.4方法和裝備技術研究第三十二頁，共79頁。基本方法●

基于參數(shù)相關的發(fā)酵過程多水平(尺度)問題研究的優(yōu)化技術●

發(fā)酵過程多參數(shù)調整的放大技術多參數(shù)趨勢曲線相關區(qū)分三個水平(尺度)問題生物反應器的傳遞與混和細胞代謝流的遷移不同環(huán)境條件下的代謝動力學特征基因水平的啟動與表達…關鍵技術第三十三頁，共79頁。用于發(fā)酵過程數(shù)據(jù)優(yōu)化與放大的專用裝置

以生物反應器中的觀點，在實驗室規(guī)模發(fā)酵罐，具有十四個以上發(fā)酵過程在線參數(shù)檢測或控制。在原理上與現(xiàn)有國內外生物反應器有重大區(qū)別。物料流檢測關鍵技術第三十四頁，共79頁。參數(shù)檢測配置示意圖關鍵技術第三十五頁，共79頁。在2000年上海國際工業(yè)博覽會上展出的FUS-50L(A)發(fā)酵罐關鍵技術第三十六頁，共79頁。增加了自閉環(huán)控制熱質量流量計、直插式隔膜罐壓傳感器、不同量程范圍的補料電子稱、抗干擾的高精度培養(yǎng)液稱重技術等參數(shù)檢測技術；同時直接檢測溫度、自動保護系統(tǒng)、攪拌轉速、通氣流量、罐壓、消泡、pH、溶解氧濃度（DO）、發(fā)酵液真實體積（或重量）、三個補料量、排氣CO2和O2等十四個在線參數(shù)，并在線精確計算得到OUR、CER、RQ、KLα、μ等重要的間接參數(shù)；配備功能強大的下位機控制軟件和上位機生物過程檢測軟件（BIORADARTM，專利申請?zhí)枺?0127308.6）計算機軟件包；代替噸級中試發(fā)酵罐，具有更優(yōu)越的發(fā)酵過程優(yōu)化與放大性能。新概念發(fā)酵罐的嶄新特點第三十七頁，共79頁。溫度傳感器、耐高溫pH和溶氧（DO）傳感器第三十八頁，共79頁。通氣質量流量計第三十九頁，共79頁。▲壓力傳感器▼電子秤新傳感技術第四十頁，共79頁。

補料測量與控制系統(tǒng)控制系統(tǒng)：流速調整幅度大(從0.1ml/h-5L/h)，可變速蠕動泵，占空比可調整的開關控制。第四十一頁，共79頁。全罐電子秤稱重系統(tǒng)新傳感技術第四十二頁，共79頁。博山電機稀土電機進口電機電機第四十三頁，共79頁。底閥第四十四頁，共79頁。第四十五頁，共79頁。軟件設計數(shù)據(jù)處理功能BlORADAR。在線檢測參數(shù)實驗室手工測定參數(shù)間接參數(shù)(代謝流特征或工程特征)適應多種反應器特點融合多種過程理論和控制理論工藝分析與操作遠程通訊與異地數(shù)據(jù)傳送和分析關鍵技術第四十六頁，共79頁。計算機控制與數(shù)據(jù)處理軟件包適應多種反應器特點，融合多種過程理論和控制理論，便于發(fā)酵過程工藝分析和優(yōu)化操作。第四十七頁，共79頁。工業(yè)生物過程研究方法與科學問題工業(yè)用菌種改造是高效生產的關鍵，又有難度，常規(guī)誘變育種、基因工程改造等往往在現(xiàn)有工業(yè)產菌種改造中發(fā)揮的作用有限工業(yè)生物過程更注重菌體基因變化后對生產有重大影響的表型變化，表型多態(tài)性，全局調控系統(tǒng)生物學研究工業(yè)生物過程中所有的基因、蛋白質、組分間的所有相互關系，是對生物的全域性（global）研究為特征

系統(tǒng)生物學指導的細胞生理特性研究系統(tǒng)生物學指導的工業(yè)生產菌株改造第四十八頁，共79頁。組學研究（x-ome)Transcriptome:

(DNAoligonucleotideandcDNAmicroarrays)Proteome:

(Two-dimensionalgelelectrophoresiscoupledtoMSordirectMSanalysis)Fluxome:

(isotopicallylabeledsubstratescoupledtodetectionbyGC-MSMetabolome:

(numerousanalyticalmethodsincludingLC-MSandGC-MS)measurementsinsilico:IndustrialbiotechnologyisbeginningtoexploitthebenefitsofthesetoolsrealizingthatmetabolicengineeringstrategiesforimprovedprocessdevelopmentmayfirstbescreenedinsilicoExperiment:high-probabilityofsuccesslistofgeneticperturbationsthatshouldbeexperimentallyvalidated.Highlyiterative:Theprocessishighlyiterative,withstrainconstructionandcharacterizationprovidingnewx-omedatathatcanbeusedtoimprovethemodels第四十九頁，共79頁。阿維菌素發(fā)酵蛋白譜

建立匹配組和比較組

其中“△”為Landmarker，“□”和“□”為手動匹配蛋白點，其余字母代表自動匹配蛋白點在對應的2-DE凝膠上進行切點、酶解、MS/MS鑒定。根據(jù)肽指紋圖譜（PMF）信息，通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行搜索，共有132種蛋白被成功匹配第五十頁，共79頁。碳水化合物運輸和代謝為例差異蛋白質分析

S.avermitilis

在TSB（左）和復合培養(yǎng)基（右）中差異表達蛋白點（碳代謝）。“○”代表復合培養(yǎng)基上調蛋白點；“□”代表復合培養(yǎng)基中下調蛋白點amyA2編碼的α淀粉酶icdA編碼的異檸檬酸脫氫酶第五十一頁，共79頁。生物芯片中心SOM分析阿維菌素合成速率與基因表達第五十二頁，共79頁。生物信息處理顯著性趨勢分析（STC） 主流表達趨勢所含基因的功能顯著性分析（Stc-GO） 差異基因表達調控的動態(tài)網絡——Dynamic-GeneNet基因功能的顯著性分析——GO-Analysis顯著性功能之間的相互作用網絡—GO-Map

信號轉導通路的顯著性分析——PathwayAnalysis

通路間的相互作用網絡分析—Path-Net信號流分析——Signal-flow

第五十三頁，共79頁。Yx/sYp/smoYp/sYx/smo恒化器(chemostat)與宏觀動力學研究第五十四頁，共79頁。13C微觀代謝流測試批發(fā)酵、動態(tài)生長與生產階段中心代謝與次級代謝第五十五頁，共79頁。維生素B12發(fā)酵不同代謝途徑支路代謝物的13C豐度第五十六頁，共79頁。

生物反應器流場特性與細胞生理特性相結合的過程放大技術第五十七頁，共79頁?？茖W問題的提出生物體與環(huán)境變化的適應性──環(huán)境組學反應器流場特性的非一致性──不可能同時做到放大時幾何相似、流體遠動學相似、流體動力學相似主要靠人工經驗的逐級放大，周期長、效果差第五十八頁，共79頁。基因組測序組學分析構建全基因組代謝模型細胞功能模擬、預測基因靶點基因操作：基因增強基因敲除異源表達宏觀代謝特性代謝流為核心的過程組學分析代謝特性的動態(tài)多尺度相關分析過程調控目標過程控制過程優(yōu)化菌種改造過程性能評估恒化培養(yǎng)計量化學研究組學分析:微觀代謝解析新代謝網絡FBA生物過程研究（時變）比較基因基因注釋環(huán)境特性研究細胞內生命過程高噸位發(fā)酵罐放大流場特性CFD模擬生物反應器過程研究（不均勻流場）過程放大Insilicowet高通量篩選細胞結構性能研究（靜態(tài)）多輪操作多輪操作多輪操作多尺度參數(shù)相關分析基于系統(tǒng)生物技術的工業(yè)生物制造研究第五十九頁，共79頁。多尺度參數(shù)相關分析方法在檸檬酸發(fā)酵過程優(yōu)化中的應用第六十頁，共79頁。解除ATP、檸檬酸的抑制AMPPi激活作用NH4+丙酮酸代謝固定CO2順烏頭酸酶失活：

Fe2+異檸檬酸失活:

Cu2+0.3mg/L、Fe2+2mg/L和pH2.0情況下α-酮戊二酸脫氫酶的調節(jié):高葡萄糖和NH4+阻遏檸檬酸積累的代謝調節(jié)產品第六十一頁，共79頁。1.3-二磷酸甘油酸ADPATP3磷酸甘油酸葡萄糖甘油醛-3-磷酸NADHNAD+PEP丙酮酸ADPATP乙酰CoANAD+NADH1/2O2+H+NADH呼吸鏈NAD+2e-H2O3ATP3ADP能荷增加則抑制PFK等關鍵酶的酶活，使葡萄糖到檸檬酸的代謝受影響。能荷的調節(jié)保證NAD+供應氧的需求對PFK的抑制第六十二頁，共79頁。原有發(fā)酵過程中的控制參數(shù)

現(xiàn)有生產中是很粗獷的，在培養(yǎng)過程中除了對溫度和罐壓進行控制外，其他的都處于不控制狀態(tài)。（沒有溶氧儀、空氣流量計等），培養(yǎng)過程中不調控pH、不流加其他任何物質。───摘自中糧豐原生物化學公司技術報告O2、CO2、pH、無機離子、NH4、糖、氮源…菌種誘變、基因改造、途徑酶活、…發(fā)酵過程全局優(yōu)化？第六十三頁，共79頁。

用于檸檬酸發(fā)酵研究的實驗室裝置尾氣分析系統(tǒng)—質譜儀多參數(shù)實驗室檸檬酸發(fā)酵罐（包括CO2、OPR、生物量等16個傳感器和控制回路）第六十四頁，共79頁?；谏镄畔⑻幚淼纳镞^程研究第六十五頁，共79頁。宏觀代謝流與微觀代謝流丙酮酸代謝固定CO2跨尺度測量RQ與產物之間的關系研究RQ值動態(tài)變化與菌種改造、操作條件（操作、培養(yǎng)基、設備）的關系細胞內：代謝途徑中的CO2固定RQ檸檬酸產物發(fā)酵罐測量參數(shù)第六十六頁，共79頁。供氧與RQ值之間的關系OUR下降，RQ上升：缺乏NAD+→CO2固定↓40%臨界氧：成團菌絲內氧擴散梯度增加當DO↓→OUR↓耗氧與RQ值的關系：NAD缺乏40%臨界氧：菌絲成團菌形與產量：高產表型PCO2與固定CO2的關系流場（剪切、濃度）與菌形、O2、CO2的關系：裝備設計與放大第六十七頁，共79頁。不同操作條件下的參數(shù)相關特性第11批全清液發(fā)酵活細胞電容值X、干重（菌濃）、pH與OUR、CER關系第9批發(fā)酵過程溫度對OUR的影響第8、9和10批發(fā)酵過程RQ等參數(shù)變化第六十八頁，共79頁。可提供的平臺技術多尺度參數(shù)相關過程優(yōu)化研究技術菌體細胞生理特性的恒化器技術研究流場特性與生理特性研究相結合過程放大技術過程宏觀代謝流、傳感器配置與在線數(shù)據(jù)處理技術發(fā)酵過程計算機數(shù)據(jù)處理與控制軟件包生物反應器CFD流場特性研究穩(wěn)定性13C微觀代謝流測定技術發(fā)酵過程蛋白譜研究技術發(fā)酵過程轉錄譜與基因芯片技術研究菌種基因工程改造與系