高氧對(duì)肺損傷患兒的影響研究,細(xì)胞生物學(xué)論文

高氧對(duì)肺損傷患兒的影響研究,細(xì)胞生物學(xué)論文近年隨著科技的進(jìn)步，越來(lái)越多的極度早產(chǎn)兒和極低出生體質(zhì)量?jī)盒掖嫦聛?lái)，但是由于長(zhǎng)期吸入高濃度氧，患兒可發(fā)生肺損傷，嚴(yán)重者甚至發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良〔BPD〕[1,2].當(dāng)下，高氧性肺損傷的機(jī)制尚不清楚，近期研究的熱門(mén)主要集中在氧化應(yīng)激方面[3,4],而NAD+依靠性的組蛋白去乙?；浮睸IRT1〕在氧化應(yīng)激及DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[5].本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)建立高氧損傷人肺泡上皮細(xì)胞〔HPAEC〕模型[6],討論SIRT1轉(zhuǎn)位能否介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而為減輕高氧肺損傷尋找新的治療靶點(diǎn)。1材料與方式方法。1.1細(xì)胞、儀器及試劑HPAEC細(xì)胞購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。LX71型倒置相差顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司，F(xiàn)ORMA311型CO2培養(yǎng)箱、胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，ANNEXINV流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司，單克隆小鼠抗SIRT1抗體購(gòu)自博士德生物公司，羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自ZSGB-BIO公司，DAPI購(gòu)自碧云天生物公司，抗熒光淬滅封片液購(gòu)自碧云天生物公司，單克隆小鼠抗SENP1抗體與單克隆抗乙?；痯53lys〔382〕抗體購(gòu)自Abcam公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。l.2HPAEC細(xì)胞培養(yǎng)先將HPAEC細(xì)胞復(fù)蘇，參加含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，放入37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。1.3HPAEC細(xì)胞分組及高氧干涉取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后傳代接種于培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為高氧組、對(duì)照組。對(duì)照組不作處理，放置于50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；高氧組換液1次后，以3L/min的速度通入含900ml/LO2和50mL/LCO2高純混合氣，通入時(shí)間為10min,參照我們前期高氧模型建立的方式方法[6].分別培養(yǎng)24h〔高氧組細(xì)胞干涉24h后，使用測(cè)氧儀檢測(cè)培養(yǎng)瓶中氧濃度，假如氧濃度90%則棄去該標(biāo)本〕,之后收集HPAEC細(xì)胞。1.4HPAEC細(xì)胞凋亡情況觀察兩組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，根據(jù)凱基ANNEXINV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒講明書(shū)操作。1.5HPAEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并照相。1.6HPAEC細(xì)胞SIRT1蛋白轉(zhuǎn)位情況觀察將HPAEC細(xì)胞消化后，按細(xì)胞密度為2104/孔接種于6孔板中蓋玻片上培養(yǎng)，同步化細(xì)胞，兩組均參加1mL培養(yǎng)基，高氧組另通入高濃度氧，分別培養(yǎng)24h;多聚甲醛固定細(xì)胞10min;0.3%TritonX-100打孔10min;5%封閉血清在37℃封閉30min;將稀釋的抗體SIRT1〔終濃度為1∶100〕滴加在細(xì)胞爬片上，4℃冰箱孵育過(guò)夜，在避光情況下將羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG〔終濃度為1∶50〕,37℃濕盒中孵育60min;用PBS洗滌3次，滴加DAPI復(fù)染，免疫共聚焦顯微鏡下觀察并照相；每張細(xì)胞爬片截取5個(gè)視野，每組8張爬片，并照相，計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)位率。1.7HPAEC細(xì)胞SENP1、乙?；痯53蛋白檢測(cè)采用Westernblotting法。兩組細(xì)胞培養(yǎng)干涉24h〔細(xì)胞生長(zhǎng)80%融合〕,胰酶消化后PBS沖洗，離心并移去上清。加入200L裂解混合液，冰浴30min,離心取上清，電泳、轉(zhuǎn)膜，參加一抗，再參加顯色的二抗，以TBST清洗，使用ECL進(jìn)行結(jié)果的顯影，然后用Labworks4.6分析目的條帶的灰度值。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方式方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以xs表示，組間比擬采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比擬采用2檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果。高氧組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為24.77%2.17%、5.33%2.60%,兩組比擬，P0.05.高氧組細(xì)胞從正常的長(zhǎng)梭形、多角形變成圓形、橢圓形，細(xì)胞間的間隙增寬，懸浮的細(xì)胞較多；對(duì)照組細(xì)胞大多為長(zhǎng)梭形、多角形，貼壁較好，細(xì)胞間的間隙較小，懸浮的細(xì)胞較少。高氧組和對(duì)照組細(xì)胞SIRT1蛋白轉(zhuǎn)位率分別為88.89%〔96/108〕、16.23%〔25/154〕,兩組比擬，P0.05.高氧組和對(duì)照組細(xì)胞SENP1蛋白相對(duì)表示出量分別為0.760.12、0.670.02,乙?；痯53蛋白相對(duì)表示出量分別為0.810.07、0.520.03,兩組比擬，P均0.05.3討論。近年來(lái)，早產(chǎn)兒的出生率逐年增高，早產(chǎn)兒中大部分會(huì)發(fā)生夭折，氧療是提高早產(chǎn)兒存活率的有效方式方法，但是長(zhǎng)時(shí)間高濃度吸氧可導(dǎo)致肺損傷，進(jìn)而導(dǎo)致BPD的發(fā)生[7].活性氧簇〔ROS〕增加所致的氧化應(yīng)激損傷是早產(chǎn)兒高氧肺損傷發(fā)生的主要機(jī)制[8],而SIRT1蛋白能顯著降低ROS水平和促進(jìn)細(xì)胞生存[9].SIRT1蛋白是一種NAD+依靠性脫乙酰酶，作為哺乳動(dòng)物生命周期相關(guān)蛋白，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反響和調(diào)控生命周期。SIRT1蛋白主要定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞能量代謝、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期控制、抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化逆境和延長(zhǎng)細(xì)胞壽命方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，是機(jī)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白[10,11].Yang等[12]用紫外線輻射、過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，SIRT1蛋白可發(fā)生翻譯后修飾，在734位賴氨酸上發(fā)生小泛素樣修飾蛋白〔SUMO〕修飾。該修飾決定著SIRT1蛋白在細(xì)胞核的定位。這是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、可逆的經(jīng)過(guò)，其去SUMO修飾的經(jīng)過(guò)則由SENP1介導(dǎo)[13,14].SIRT1蛋白主要存在于細(xì)胞核，少量存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)SIRT1蛋白能被SENP1去SUMO化，使p53蛋白的第382位賴氨酸殘基去乙?；瘻p少，抑制p53與靶DNA順式原件結(jié)合，進(jìn)而抑制p53促凋亡活性[15~18].本研究顯示，高氧組細(xì)胞生長(zhǎng)較差，細(xì)胞間隙增寬，懸浮細(xì)胞較多，細(xì)胞的凋亡率增加，這與我們的前期實(shí)驗(yàn)[6]結(jié)果一致，即高氧能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究還顯示，高氧組SENP1蛋白表示出、SIRT1轉(zhuǎn)位率、乙?；痯53表示出均較對(duì)照組升高，這與Yang等[12]結(jié)果一致。提示高氧可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其凋亡的機(jī)制與SIRT1蛋白相關(guān)?？傊?，高氧誘導(dǎo)SENP1蛋白表示出，促使SIRT1蛋白發(fā)生去SUMO化，發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)位，去乙?；钚詼p低，對(duì)p53去乙?；钚詼p低，乙?；痯53相對(duì)增加，進(jìn)而激活下游的凋亡通路而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以下為以下為參考文獻(xiàn)：[1]HilgendorffA,ReissI,EhrhardtH,etal.Chroniclungdiseaseinthepreterminfant.Lessonslearnedfromanimalmodels[J].AmJRespirCellMolBiol,2020,50〔2〕:233-245.[2]JinL,YangH,FuJ,etal.AssociationbetweenoxidativeDNAdamageandtheexpressionof8-oxoguanineDNAglycosylase1inlungepithelialcellsofneonatalratsexposedtohyperoxia[J].MolMedRep,2021,1