實(shí)驗(yàn)九質(zhì)粒DNA的制備課件

實(shí)驗(yàn)四

堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來(lái)自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體。質(zhì)粒類型質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：1.松弛型質(zhì)粒

松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白。即使蛋白質(zhì)合成受抑制，質(zhì)粒的復(fù)制依然進(jìn)行。當(dāng)抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素等抗生素存在時(shí)，質(zhì)粒的拷貝數(shù)可達(dá)2000-3000拷貝。質(zhì)粒的應(yīng)用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來(lái)表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。分離質(zhì)粒DNA方法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的堿變性法；煮沸法；SDS法；羥基磷灰石層析法等

各方法分離是依據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成及結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)加以選擇的，其中堿變性法既經(jīng)濟(jì)且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)要求掌握最常用的質(zhì)粒的提取方法。堿變性法基本原理在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。pUC19

鏈長(zhǎng)2,686bp多克隆位點(diǎn)：EcoRI,SacI,KpnI,SmaI,BamHI,XbaI,SalI,PstI,SphI和HindIII只有一個(gè)酶切位點(diǎn)。用途克隆外源基因。利用lacpromoter進(jìn)行基因表達(dá)。使用M13primers進(jìn)行DNA測(cè)序。

三．實(shí)驗(yàn)方法

1.挑單克隆E.coli菌株接種到培養(yǎng)基上（活化菌種），37℃過(guò)夜培養(yǎng)2.從培養(yǎng)基上挑E.coli菌株，接種于25毫升液體培養(yǎng)液內(nèi)（含氨芐），37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)3.從中取4毫升種子菌液于LB培養(yǎng)基中（含Amp），37℃振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)

一

細(xì)菌培養(yǎng)與質(zhì)粒擴(kuò)增

7．加入等體積異丙醇，振蕩混勻，于室溫靜置5分鐘,12000r4℃離心15分鐘。8．棄上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴(yán)管蓋顛倒數(shù)次，8000r于離心5分鐘。9．棄上清，抽干乙醇，室溫干燥（5-15分鐘）。10．加入20μlTE（含20μg/ml

RNA酶，不含DNA酶）溶解DNA。問(wèn)題與討論：

１．簡(jiǎn)要敘述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及實(shí)驗(yàn)中分別加入上述溶液后，反應(yīng)體系出現(xiàn)的