乳酸脫氫酶法操作說明

LDH法細(xì)胞毒性檢測(cè):原理：乳酸脫氫酶在胞漿內(nèi)含量豐富，正常時(shí)不能通過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受損或死亡時(shí)可釋放到細(xì)胞外，所以細(xì)胞死亡數(shù)目與細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性成正比,用比色法測(cè)定實(shí)驗(yàn)孔LDH活性,并與靶細(xì)胞對(duì)照孔進(jìn)行比較，可計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷百分率LDH（乳酸脫氫酶）是一種極為穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)酶，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸鹽，和INT（四唑鹽類）反應(yīng)轉(zhuǎn)化成紅色甲臆化合物，可通過酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。顏色形成的量與裂解細(xì)胞的數(shù)目成正比。應(yīng)用一個(gè)96-孔平板讀數(shù)計(jì)收集可見光波長(zhǎng)的吸收值數(shù)據(jù)。這個(gè)分析可用于測(cè)量在細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性分析中細(xì)胞膜的完整性，這種情況下目標(biāo)細(xì)胞被效應(yīng)細(xì)胞裂解，可判斷細(xì)胞受損的程度。乳酸脫氫酶（LDH）在胞質(zhì)內(nèi)含量非常豐富，細(xì)胞處于正常狀態(tài)下其不能通過細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞受到損傷或死亡時(shí)便可釋放到細(xì)胞外，此時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性與細(xì)胞的死亡數(shù)目呈正比，通過用比色法測(cè)定并與靶細(xì)胞對(duì)照孔的LDH活性進(jìn)行比較，可計(jì)算出效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷百分?jǐn)?shù)。該實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便、快速，可應(yīng)用于CTL和NK細(xì)胞活性測(cè)定及藥物、化學(xué)物質(zhì)或放射所引起的細(xì)胞毒性，目前已有LDH法測(cè)定CTL活性的試劑盒。同時(shí)設(shè)4個(gè)對(duì)照:靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正對(duì)照組、背景對(duì)照組和自然釋放組按5：1、10：1、20:1（效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞）細(xì)胞過度生長(zhǎng)、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大等因素會(huì)造成細(xì)胞自然釋放乳酸脫氫酶操作流程：設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞孔（不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組）：50/效應(yīng)細(xì)胞+50/培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組：靶細(xì)胞不變，改變效應(yīng)細(xì)胞：50gl效應(yīng)細(xì)胞+50gl靶細(xì)胞設(shè)立靶細(xì)胞自發(fā)釋放組：50/靶細(xì)胞+50gl培養(yǎng)基設(shè)立靶細(xì)胞最大釋放組：50gl靶細(xì)胞+50gl培養(yǎng)基+10/裂解液（10x）設(shè)立體積校正對(duì)照組：100/培養(yǎng)基+10gl裂解液（10x）設(shè)立背景對(duì)照組：100叫培養(yǎng)基250g離心4分鐘37°C孵育4小時(shí)離心前45分鐘添加裂解液（10x）至靶細(xì)胞最大釋放組250g離心4分鐘取上清50gl轉(zhuǎn)移至另一孔板（可選）于獨(dú)立的孔中加50glLDH陽性對(duì)照（1：5000）于每孔中添加50gl再次稀釋的底物混合物室溫避光孵育30分鐘添加50gl終止溶液490nm測(cè)吸收值靶細(xì)胞接種數(shù)目的優(yōu)化設(shè)立檢測(cè)板準(zhǔn)備靶細(xì)胞：調(diào)整細(xì)胞濃度0,5,000,10,000,20,000/100gl，使用與細(xì)胞毒分析相同的培養(yǎng)基及孔板終體積。例如，若以50M/孑L的靶細(xì)胞及50ul/孔的效應(yīng)細(xì)胞接種，則以100ul/孔梯度稀釋。設(shè)置不含細(xì)胞的背景對(duì)照組可選:驗(yàn)證LDH陽性對(duì)照。使用渦旋混勻器輕輕混勻LDH陽性對(duì)照液，以1：5000稀釋（稀釋方法：取2M原液至10ml的PBS+1%BSA）。使用與實(shí)驗(yàn)孔相同的體積。1.2.細(xì)胞裂解及收獲上清裂解細(xì)胞每100Ul培養(yǎng)基加10Ul裂解溶液（10x）37°C,5%CO2孵育45分鐘250g離心4分鐘LDH檢測(cè)轉(zhuǎn)移50Ul上清至另一孔板解凍檢測(cè)緩沖液，取12ml（避光），將剩余的迅速凍存（可以使用37C水浴解凍，但不可放置過長(zhǎng)時(shí)間）。將12ml檢測(cè)緩沖液添加到一瓶底物混合液（可用于兩個(gè)96孔板）中，倒置混勻。稀釋后，避光、迅速添加。50ul/孔添加稀釋的底物混合液，室溫避光孵育30分鐘（未使用的稀釋后底物混合物液放于-20C保存6-8周）添加50gl終止溶液將孔中含有的氣泡去除，一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)吸收值（490或492nm）至少檢測(cè)兩次吸收值接種靶細(xì)胞（100ul^L）至96孔板加入裂解液（或凍存-解凍）250g離心4分鐘取上清50gl轉(zhuǎn)移至另一孔板用檢測(cè)緩沖液稀釋底物混合物添加底物混合物50gl/孔室溫避光孵育30分鐘添加50gl終止溶液490nm測(cè)吸收值細(xì)胞毒分析檢測(cè)設(shè)立檢測(cè)板效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組設(shè)立不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組，終體積與實(shí)驗(yàn)孔一致實(shí)驗(yàn)組加入相同數(shù)目的靶細(xì)胞，按照不同效靶比加入效應(yīng)細(xì)胞，補(bǔ)足培養(yǎng)基（最小體積:100叫/孔）。靶細(xì)胞自發(fā)釋放組加入最優(yōu)化的靶細(xì)胞數(shù)，補(bǔ)足終體積靶細(xì)胞最大釋放組加入最優(yōu)化的靶細(xì)胞數(shù)，補(bǔ)足終體積。體積校正對(duì)照組100gl培養(yǎng)基中加入10gl的裂解液，用于校正由于加入裂解液而引起的體積變化（體積改變影響酚紅及血清的含量）。背景對(duì)照組用于校正培養(yǎng)基中由酚紅及血清引起的LDH影響。LDH陽性對(duì)照（可選）使用渦旋混勻器輕輕混勻LDH陽性對(duì)照液，以1：5000稀釋（稀釋方法：取2ul原液至10ml的PBS+1%BSA）。使用與實(shí)驗(yàn)孔相同的體積250g離心4分鐘，以使效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞充分接觸2.2.細(xì)胞培養(yǎng)、收獲上清2.2.1.37C，5%CO2孵育檢測(cè)板（效靶細(xì)胞接觸的最短時(shí)間為4小時(shí)）靶細(xì)胞最大釋放組中加入裂解液每100時(shí)培養(yǎng)基加10ul裂解溶液（10X）。該體系中TritonX-100的濃度為0.8%，可使靶細(xì)胞完全裂解（收獲上清前45分鐘加入裂解溶液）。顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，若靶細(xì)胞未完全裂解，再補(bǔ)5ul的裂解液。250g離心4分鐘LDH檢測(cè)轉(zhuǎn)移50M上清至另一孔板解凍檢測(cè)緩沖液，取12ml（避光），將剩余的迅速凍存（可以使用37°C水浴解凍，但不可放置過長(zhǎng)時(shí)間）。將12ml檢測(cè)緩沖液添加到一瓶底物混合液（可用于兩個(gè)96孔板）中，倒置混勻。稀釋后，避光、迅速添加。50ul/孔添加稀釋的底物混合液，室溫避光孵育30分鐘（未使用的稀釋后底物混合物液放于-20C保存6-8周）添加50以終冬止溶液將孔中含有的氣泡去除，一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)吸收值（490或492nm）2.4.結(jié)果統(tǒng)計(jì)所有的實(shí)驗(yàn)組、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組的吸收值應(yīng)減去背景平均吸收值靶細(xì)胞最大釋放組的吸收值應(yīng)減去體積校正對(duì)照組的平均吸收值校正后的值用于殺傷率的統(tǒng)計(jì)：細(xì)胞殺傷率（%）=:（實(shí)驗(yàn)組釋放-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放）/（靶細(xì)胞最大釋放-靶細(xì)胞自發(fā)釋放）］X100%對(duì)岫試驗(yàn)組對(duì)岫①敕放到胞白爰LUH辟放眄不同教拒蟲燦應(yīng)翹胞”總*1/、亳5心、riO^'tOOpD例靶細(xì)胞景大LD且祥顯量倒靶餉脂自發(fā)LD1I釋故屈④硼培弄液LDH梓艦易尊Volumet-orrecri-on不同戮呆的效應(yīng)紙胞＜1-25-10\2.5?!0\S?10\1*10叫購］lL）別和細(xì)圍■混合后M入96孔板壽昵心Ein后3TC孵”'4h離心襯加入IOX