ES細胞的誘導與應(yīng)用課件

ES細胞的誘導與應(yīng)用

本次課的主要內(nèi)容ES細胞的定義，及其研究發(fā)展史。ES細胞的分離培養(yǎng)和生理特性。ES細胞的自我更新，誘導分化。ES細胞的應(yīng)用前景和所面臨的挑戰(zhàn)。一、什么是ES細胞一般來講，ES細胞是指從早期的囊胚中的內(nèi)細胞團（innercellmass,ICM)分離得到的具有無限增殖能力和多分化潛能的一類干細胞。兩個重要特性：（1）多潛能性分化，可分化成三胚層以內(nèi)的所有細胞。（2）可無限的保持未分化狀態(tài)，擴增傳代。二、胚胎干細胞研究的進展情況：1981年，Evans和Martin分別成功的分離和體外培養(yǎng)了小鼠的胚胎干細胞。1995年，Thomson等人分離建立了第一株靈長類動物的胚胎干細胞。1998年，Thomson等建立了第一株人類胚胎干細胞。1998年，Shamblott等建立了第一株人類生殖干細胞。2006年，Yamanaka建立誘導多能干細胞（inducedpluripotentstemcell,IPS）

胚胎干細胞系的建立過程分離囊胚的內(nèi)細胞群IPS與成纖維細胞共培養(yǎng)，ES細胞非分化增殖分離胚胎生殖腺脊細胞

------胚胎干細胞的鑒定------定向誘導分化-------成體干細胞-----功能細胞ES細胞培養(yǎng)過程ES與EG細胞ES細胞培養(yǎng)過程IPS三、ES細胞的細胞特性1、細胞形態(tài)：與早期胚胎細胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，胞體體積小，核大，有一個或多個核仁，核仁清晰，多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，散布大量核糖體和線粒體。核型正常，具有穩(wěn)定的整倍體核型。

三、ES細胞的細胞特性2、生長特性：

ES細胞在體外分化抑制培養(yǎng)時，呈克隆狀生長，細胞緊密的聚集在一起，圓形或卵圓形，細胞均呈單層或多層緊密堆積，形成島狀或巢狀的群體細胞克隆，細胞之間的界限不清，克隆周圍可見單個ESC和分化的扁平狀上皮細胞。四、ES細胞的分子生物學標志1、堿性磷酸酶（AKP）ES細胞含有豐富的堿性磷酸酶，活性高。但在已經(jīng)分化的ES細胞中堿性磷酸酶則呈弱陽性或陰性，因此常作為ES細胞鑒別和區(qū)分ES細胞分化與否的重要標志之一。2、端粒酶ES細胞表現(xiàn)出高水平的端粒酶活性，不同于正常的二倍體細胞，可能是其復制生命期限遠比體細胞長的原因。研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶的減少是細胞衰老的重要機制之一，但在ES細胞、生殖細胞和腫瘤細胞中，端粒酶呈高水平表達，具有高活性，在細胞每次分裂之后，可保持端粒長度，進而維持細胞的長期存活。四、ES細胞的分子生物學標志3、胚胎階段特異性表面抗原（SSEA）

SSEA是一種糖蛋白，常表達于胚胎發(fā)育早期的細胞，ES細胞中SSEA表達陽性，可作為ES細胞的標記分子之一，用于鑒別。然而，不同種屬的動物，其表面抗原組成并不完全一致。五、ES細胞的誘導分化

當鑒別一株細胞是不是ES細胞時，除了要經(jīng)過以上的檢測：形態(tài)和生長特性，染色體核型分析，特異性表面抗原等。更重要的是要看其是否具有多分化潛能。ESC的誘導分化一般可分為：（1）體外誘導分化（2）定向誘導分化（3）體內(nèi)分化五、ES細胞的誘導分化干細胞誘導分化的常用方法：（1）加入誘導細胞分化的因子或化學物質(zhì)，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等。（2）將ES細胞與特定的細胞共培養(yǎng)。（3）將某種分化誘導因子的基因轉(zhuǎn)入ES細胞內(nèi)。

五、ES細胞的誘導分化（1）體外誘導分化：其又可分為兩種：去除抑制因子的細胞單層培養(yǎng)法。將ESC消化后不貼壁的懸浮或懸滴培養(yǎng)法：可形成EB，其在體外可誘導分化成各類細胞。常用的誘導劑：維甲酸（RA）、二甲基亞砜（DMSO）和環(huán)六甲基雙乙胺（HMBA）等。五、ES細胞的誘導分化（1）定向誘導分化：例如，ESC在含DIA的條件培養(yǎng)基中呈未分化生長，去除DIA后，細胞則向中胚層分化，而在DIA和RA同時存在時，ESC可被誘導分化成體壁細胞。ESC在高密度條件下生長時，可分化成多種不同類型的細胞，而在低密度條件下生長時，則只是分化成少數(shù)幾種類型細胞。五、ES細胞的誘導分化（4）嵌合體動物實驗：參與宿主胚胎發(fā)育，并形成嵌合體動物，包括生殖系嵌合體后代，是ESC的最基本特征。五、ES細胞的誘導分化（4）嵌合體動物實驗：ESC與正常胚胎嵌合，如能產(chǎn)生包括生殖系在內(nèi)的各個組織器官，且能長生功能性配子的嵌合體（種系嵌合體），則可證實所分離得到的是具有發(fā)育全能性的ES細胞系。嵌合體實驗通常有兩種方法：胚胎聚集法。顯微注射法。BALB/C-C57胚胎嵌合體小鼠六、ES細胞的應(yīng)用

人體發(fā)生過程：受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋養(yǎng)層胎盤及胎兒附屬結(jié)構(gòu)囊胚內(nèi)胚層消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰。內(nèi)細胞群中胚層結(jié)締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng)外胚層體表結(jié)構(gòu)；神經(jīng)系統(tǒng)六、ES細胞的應(yīng)用七、ES細胞研究所面臨的挑戰(zhàn)和前景存在問題：技術(shù)問題：基因機制不清，誘導分化不純，移植不理想。安全性問題：腫瘤性倫理問題：全球性大討論倫理問題ES細胞研究涉及到人類胚胎、生命的權(quán)利、器官再造等一系列倫理學、宗教等敏感問題，使其一直為宗教和人權(quán)等組織所反對。美國有7個州禁止任何形式的克隆人行為，11個州立法抵制胚胎干細胞研究。布什政府在，2001年批準聯(lián)邦財政可以支持政府批準的干細胞系研究。ES