堿性磷酸酶比活力測(cè)定課件

堿性磷酸酶比活力的測(cè)定1.學(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法2.掌握堿性磷酸酶比活測(cè)定的方法一、目的要求二、原理（一）、比色分析法光的互補(bǔ)示意圖1.物質(zhì)的顏色和波長(zhǎng)：可見(jiàn)光：波長(zhǎng)（λ）400—760nm紫外光：λ小于400nm紅外光：λ大于760nm2.溶液的顏色和光吸收的關(guān)系：溶液的顏色，是由于不同的有色物質(zhì)有選擇地吸收某種顏色的光而引起的。溶液呈現(xiàn)的顏色是與它主要吸收的光相互補(bǔ)的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深。4.待測(cè)溶液濃度的計(jì)算：（1）標(biāo)準(zhǔn)管法：在同樣條件下，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)液的光密度（D）值，然后計(jì)算：C未知=（D未知/D標(biāo)準(zhǔn)）×C標(biāo)準(zhǔn)（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：分析大批待測(cè)樣品時(shí)，采用此法較方便。先配制一系列濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)出它們的光密度（D）值。在一定濃度范圍內(nèi)，溶液濃度（C）與其光密度（D）之間呈直線(xiàn)關(guān)系。以各管D為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。待測(cè)溶液D值測(cè)出后，在曲線(xiàn)上查出C。1%濃度，1cm厚度溶液中測(cè)得：K=E1cm1%或１克分子濃度，１cm厚度溶液中測(cè)得：K=ξC=D/E1cm%,或C=D/ξ常用于紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)，核酸含量，二者分別在280nm和260nm處有最大吸收，其消光系數(shù)可查到，在同樣條件下，測(cè)定待測(cè)溶液的光密度,帶入上式即可求得C。（3）消光系數(shù)法：（二）、酶活力在37C下，以5mmol/LpNPP為底物，在pH10.1的碳酸鹽緩沖液含2mmol/LMg2+的測(cè)活體系中每分鐘催化產(chǎn)生1mol/LpNP的酶量定為1個(gè)酶活力單位。酶的比活力定義為每mg蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。酶活性測(cè)定前處理1、2號(hào)樣品稀釋50倍（用洗脫液稀釋?zhuān)?號(hào)樣品稀釋20倍（用洗脫液稀釋?zhuān)?號(hào)樣品不稀釋?zhuān)ㄓ孟疵撘合♂專(zhuān)┑鞍诐舛葴y(cè)定前處理1、2號(hào)樣品稀釋100倍（用洗脫液稀釋?zhuān)?號(hào)樣品稀釋20倍（用洗脫液稀釋?zhuān)?號(hào)樣品對(duì)倍稀釋?zhuān)ㄓ孟疵撘合♂專(zhuān)┑鞍诐舛葴y(cè)定1.測(cè)定100μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值；2.將稀釋后的樣品在280nm下測(cè)定吸光度；3.以洗脫液作空白。蛋白濃度按下式計(jì)算：數(shù)據(jù)處理單位