感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選專家講座

試驗(yàn)五

感受態(tài)制備、

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和篩選-10-30感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第1頁(yè)試驗(yàn)安排感受態(tài)制備質(zhì)粒轉(zhuǎn)化第二天，觀察結(jié)果質(zhì)粒酶切--電泳檢測(cè)上次試驗(yàn)產(chǎn)物（質(zhì)粒）感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第2頁(yè)酶切電泳點(diǎn)樣安排電泳上樣：1、全部同學(xué)各自酶切產(chǎn)物（10-20μl）2、每排點(diǎn)樣孔需有兩種質(zhì)粒：pUC119、pUC119-U63、同一人“酶切前”與“酶切后”相鄰點(diǎn)樣感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第3頁(yè)試驗(yàn)步驟加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，4000rpm×10min加入冰涼CaCl2溶液300μl，重懸菌體沉淀中加入冰涼CaCl2溶液120μl，重懸菌體感受態(tài)制備冰浴15-30min，4000rpm×10min搜集沉淀，去上清搜集沉淀，去上清（去掉培養(yǎng)基）感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第4頁(yè)試驗(yàn)步驟每管感受態(tài)中加質(zhì)粒5μl，混勻42℃，熱激90秒，勿搖動(dòng)每管加LB500μl，37℃搖床，復(fù)蘇30-40min鋪200μl菌液到LB瓊脂平板，涂勻轉(zhuǎn)化冰上靜置20-30min感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第5頁(yè)怎樣設(shè)計(jì)試驗(yàn)參考體系（對(duì)照組）？感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第6頁(yè)篩選試驗(yàn)步驟LB培養(yǎng)基（X-gal,IPTG,Amp）LB培養(yǎng)基感受態(tài)+質(zhì)粒（pUC119-U6orpUC119）感受態(tài)（無(wú)質(zhì)粒）pUC119-U6pUC119對(duì)照組B？？？對(duì)照組A？感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第7頁(yè)基因克隆應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將各種起源遺傳物質(zhì)（同源或異源、原核或真核、天然或人工DNA）與載體DNA接合成一含有自我復(fù)制能力DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取取得大量同一DNA分子，也稱DNA克隆或重組DNA(recombinantDNA)。感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第8頁(yè)基因克隆示意圖感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第9頁(yè)基因克隆操作過(guò)程：分分離目標(biāo)基因切限制酶切目標(biāo)基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第10頁(yè)受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺點(diǎn)處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)重組DNA導(dǎo)入受體菌感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第11頁(yè)LB0.18M0.1MCaCl20.1MCaCl2H2O細(xì)胞膨脹：低滲環(huán)境胞膜收縮：低溫環(huán)境離子擴(kuò)散：DNA-Ca2＋熱休克：42℃1LLB培養(yǎng)基:10g胰蛋白胨5g酵母提取物10gNaCl感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第12頁(yè)

重組體篩選

重組DNA導(dǎo)入受體菌后，經(jīng)過(guò)培 養(yǎng)使其大量繁殖，再設(shè)法將含有目標(biāo)基因菌落區(qū)分判定出來(lái)，這一過(guò)程即為篩選（screening）或選擇（selection）。感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第13頁(yè)重組體篩選

1.直接選擇法(1)抗藥性標(biāo)識(shí)選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)－α互補(bǔ)（藍(lán)白斑篩選）(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第14頁(yè)α互補(bǔ)檢測(cè)藍(lán)白斑篩選感受態(tài)的制備質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選第15頁(yè)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率檢驗(yàn)1μg完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)化細(xì)菌數(shù)量。比如，取1μl（0.1ng/μl）完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μl感受態(tài)細(xì)胞.向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900μl培養(yǎng)液，讓細(xì)菌恢復(fù)一小段時(shí)間，取100μl鋪板.培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化0.1ngDNA，用SOC稀釋到1000μl后，取1/10涂平板，則涂平板共用0.01ngDNA質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化率＝1000克隆/0.01ngDNA=105cfu/ng=108cfu/μg轉(zhuǎn)化效率1×106cfu/μgDNA可滿足普通亞克隆試驗(yàn)；1