HPLC法測(cè)定越橘益視膠囊中葉黃素的含量

HPLC法測(cè)定越橘益視膠囊中葉黃素的含量目錄摘要 Ⅰ-Ⅱ125211前言 1116922材料與儀器 3144012.1使用的主要試藥及溶劑 3128922.2使用的主要儀器 3248723方法 4320883.1葉黃素的對(duì)照品溶液制備 4284823.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 4284823.3供試品溶液的制備 5284823.4色譜條件 5284823.5方法學(xué)考察 5178004討論 11864.1提取溶劑的選擇 1145984.2色譜條件的選擇 1245984.3方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果 14261525結(jié)論 148397參考文獻(xiàn) 165087綜述 175087致謝 22IHPLC法測(cè)定越橘益視膠囊中葉黃素的含量摘要：目的本文建立了簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確的HPLC-DAD法測(cè)定越橘益視膠囊中葉黃素的含量。方法取樣品0.3g，加水溶解后再加入含0.1%BHT的丙酮，在避光低溫的條件下超聲提取，定容，過濾。色譜條件為資生堂MGⅡ色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-甲基叔丁基醚（85:15）；流速：0.2mL/min，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)445nm。結(jié)果葉黃素在0.8488-42.44μg(r=0.9999)之間呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為96.42%，RSD為3.46%。結(jié)論用高效液相色譜分離，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)定葉黃素的方法精密度、穩(wěn)定性等均能滿足保健食品中葉黃素分析要求，且靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單快速，可作為越橘益視膠囊中葉黃素含量測(cè)定方法。關(guān)鍵詞：越橘益視膠囊；葉黃素；高效液相色譜法；含量測(cè)定IIDeterminationofluteininYuejuYishicapsulebyHPLCAbstract：0bjectivewesystematicallyresearcheddeterminationmethodsofluteininYuejuYishicapsulebyHPLC-DAD,whichissimpleandaccurate.Methods0.3gramsamplewith5mlwatertodissolveandthenaddedabout40ml0.1%BHTacetonewasoscillatedtoextracttheluteininlowtemperatureandfiltratedby0.45μmfilterbeforesampleinjectionfordetection.TheShiseidoMGIIC18column(4.6mm×250mm，5μm)wasusedunderthemobilephaseofmethanol-methyltert-butylenter(85:15,v/v)ataflowrateof0.2mL/min.Thecolumntemperaturewasmaintainedat25℃andthedetectionwavelengthwas445nm.ResultsTherewasagoodlinearrelationshipattherangesof0.8488-42.44μgforlutein(r=0.9999).Theaveragerecoveryratewas96.42%withrelativestandarddeviation(RSD)of3.46%.ConclusionThemethodwithHPLCseparationandDADdetectioncanmeettherequirementsforanalysisofluteininhealthcarefoodwithfeaturesofhighprecision，highstability，simpleandrapid．ItissuitablefordeterminationofluteininYuejuYishicapsule.Keywords:YuejuYishicapsule;Lutein;HPLC;ContentdeterminationPAGE221前言越橘益視膠囊以天然植物越橘提取物和葉黃素粉為主要成分，并含有多種眼睛所需的營(yíng)養(yǎng)，能夠緩解視疲勞，提高視力，具有一定的改善視力的保健功能。越橘是杜鵑花科植物，多年生落葉灌木，高至40厘米，花白色或粉紅色，果實(shí)為漿果，藍(lán)色或紅色，近圓形。其中藍(lán)果越橘(俗稱藍(lán)莓)，在世界范圍內(nèi)栽培面積最大。其主要成分有天然視紫質(zhì)（Rhodopsin）和類黃酮（Flavonoid）。視紫質(zhì)是眼睛產(chǎn)生視覺的最基本物質(zhì)，可加強(qiáng)適應(yīng)對(duì)黑暗弱光的敏感度。類黃酮具有維生素P的活性，是保護(hù)血管的物質(zhì)。葉黃素是一種具有和越橘花青素同等地位的視覺營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種非常重要的抗氧化劑，為類胡蘿卜素家族的一員，又名胡蘿卜醇。葉黃素是一種無維生素A活性的類胡蘿卜素，其分子式為C40H56O2，鏈末端含有羥基基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)式如圖1，是由8個(gè)異戊二烯為單位所組成的含有2個(gè)羥基的共軛烯烴。易溶于氯仿、二氯化碳，可溶于正己烷，微溶于醇、醚，呈黃色。在類胡蘿卜素中，葉黃素與胡蘿卜素有區(qū)別。其一，分子結(jié)構(gòu)的不同，葉黃素是含氧化合物，比胡蘿卜素的鏈末端多2個(gè)羥基，普遍認(rèn)為葉黃素比胡蘿卜素具有更強(qiáng)的抗氧化性。對(duì)于機(jī)體，葉黃素可通過自由基機(jī)理抑制活性氧自由基的活性，阻止活性氧自由基破壞正常細(xì)胞，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，因此葉黃素獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)不僅決定其顏色，更決定其其他的理化性質(zhì)。其二，葉黃素和胡蘿卜素區(qū)別之處在于，如β-胡蘿卜素具有2個(gè)β-紫蘿酮環(huán)，是最有效的維生素A原，具有維生素A的各種功能，但是人體過多食入維生素A，維生素A將在體內(nèi)沉積，損害肝臟或引起維生素A的過多癥。然而葉黃素不具有維生素A的功能，人體過多食入，不會(huì)出現(xiàn)這種副作用。葉黃素存在于視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的主要色素，有抗氧化和過濾藍(lán)光的作用[1]，從而保護(hù)眼底組織免受光毒性傷害[2]。每日人體接受的光照中，短光(藍(lán)光)對(duì)人體的傷害很大，消耗大量的葉黃素，而葉黃素在人體內(nèi)不能合成，必須補(bǔ)充一定量的葉黃素以維持身體健康。此外，葉黃素還能減少很多種眼科疾病的發(fā)生，例如老年性視網(wǎng)膜黃斑變性（AMD）、白內(nèi)障、結(jié)膜炎和畏光等[3]。因此，市場(chǎng)上出現(xiàn)了大量葉黃素保健品，為監(jiān)管葉黃素保健食品的質(zhì)量，建立一個(gè)快速高效分析葉黃素的方法非常必要。越橘益視膠囊的簡(jiǎn)要生產(chǎn)工藝如下：越橘益視膠囊以葉黃素粉、越橘提取物、牛磺酸，維生素C、天然維生素E（d-α-生育酚醋酸酯）、檸檬酸鋅、維生素A粉、食用玉米淀粉、二氧化硅、硬脂酸鎂為原料，經(jīng)稱量備料、混合、填充、內(nèi)包裝、外包裝等主要工藝加工制成的具有緩解視疲勞的“越橘益視膠囊”。具體工藝如下：將維生素A粉、檸檬酸鈉鋅加約等重量的食用玉米淀粉混合2分鐘后過60目篩，然后加入約等重量的食用玉米淀粉、配方量的天然維生素E混合均勻后和配方量的其他物料加入三維混合機(jī)中，若有結(jié)團(tuán)的需先過40目篩，混合30min至混合物色澤均勻后出料，備用，制囊。由于葉黃素的對(duì)溫度和光照環(huán)境非常敏感[4]，在低溫避光的環(huán)境下性質(zhì)較為穩(wěn)定，不易降解，而在溫度高、光照強(qiáng)、含氧量高的條件下易降解，故要求葉黃素在提取分離和分析的過程中要注意避免在高溫、光照強(qiáng)的條件下進(jìn)行，也有必要在分析的過程中加入相應(yīng)的抗氧化物質(zhì)來防止被測(cè)物的氧化破壞。通過查找相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，葉黃素的提取溶劑主要有：無水乙醇、丙酮、正己烷、石油醚、二氯甲烷等，提取方法主要有：超聲波提取法、微波提取法、干燥法、膜分離技術(shù)、超臨界CO2萃取法、酶介質(zhì)有機(jī)溶劑提取等[5]。由于葉黃素受熱不穩(wěn)定，且提取時(shí)間長(zhǎng)易降解,以及越橘益視膠囊中葉黃素的主要來源是葉黃素原料，不需酶解，故不考慮超臨界CO2萃取法、酶介質(zhì)有機(jī)溶劑提取的方法。本次試驗(yàn)的主要考慮采取超聲方法進(jìn)行提?。褐饕玫降娜軇┯兴?、無水乙醇、1%BHT丙酮。經(jīng)過討論、預(yù)實(shí)驗(yàn)和借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)，本次試驗(yàn)通過葉黃素超聲提取方法提取，篩選提取溶劑，選出超聲提取方法中的最優(yōu)方法，最終確定最佳的葉黃素提取方法。常見的葉黃素的測(cè)定方法有，高效液相色譜法，薄層掃描法，紫外-可見分光光度法等。目前，葉黃素的主要分析方法為高效液相色譜法，特別是在定性定量中使用的非常廣泛，該方法具有高效準(zhǔn)確，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。由于公司對(duì)該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未完善，未收載越橘益視膠囊中葉黃素含量的測(cè)定方法。本文對(duì)越橘益視膠囊功效成分葉黃素進(jìn)行了含量測(cè)定方法的研究，根據(jù)有效成分的理化性質(zhì)、投料類型、制備工藝特點(diǎn)，制定該產(chǎn)品葉黃素的高效液相含量測(cè)定方法，并通過方法學(xué)考察的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了方法的可行性。有助于完善本產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能夠更全面地保證越橘益視膠囊質(zhì)量。2材料與儀器2.1使用的主要試藥及溶劑使用的主要溶劑見表1、2表1樣品名稱批號(hào)及生產(chǎn)商樣品名稱批號(hào)生產(chǎn)商越橘益視膠囊201401湯臣倍健股份有限公司表2試劑、藥品及生產(chǎn)商試劑規(guī)格生產(chǎn)商葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品50mgUSP（批號(hào)G0L260）葉黃素原料湯臣倍健股份有限公司甲醇色譜純(GR)Merck甲基叔丁基醚色譜純(GR)Sigma-Aldrich二氯甲烷分析純（AR）廣州化學(xué)試劑廠丙酮分析純(AR)廣州化學(xué)試劑廠無水乙醇分析純(AR)廣州化學(xué)試劑廠2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）分析純（AR）上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司2.2使用的主要儀器使用的主要儀器見表3表3主要儀器設(shè)備型號(hào)及生產(chǎn)家主要儀器生產(chǎn)商WatersAlliancee2695型高效液相色譜配2998型DAD檢測(cè)器沃特斯公司色譜柱（CapcellpakC18MGⅡ，4.6mm×250mm，5μm）資生堂（中國）投資有限公司超聲波清洗機(jī)中國華南超聲設(shè)備廠純水器默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司電子天平（十萬分之一，41g（精細(xì)量程）/120g）梅特勒-托利多國際股份有限公司3方法關(guān)于葉黃素的測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道較多[6-8]，多為使用HPLC法，但未見測(cè)定越橘益視膠囊或相似產(chǎn)品中葉黃素含量的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)是用HPLC法對(duì)越橘益視膠囊中葉黃素進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)于方法的探討進(jìn)行如下：3.1葉黃素的對(duì)照品溶液制備3.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液稱取葉黃素對(duì)照品約20mg于20mL棕色容量瓶，用二氯甲烷溶解并定容至刻度，搖勻，即得葉黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液，其濃度為1mg/ml。在-80℃冰箱避光保存3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液4.00mL、3.00mL、2.00mL、1.00mL于100ml棕色容量瓶并用二氯甲烷定容至刻度，搖勻，即得：S7、S6、S5、S4；然后精密量取S5溶液3.00mL、1.00mL于10mL棕色容量瓶并用二氯甲烷定容至刻度，搖勻，即得S3、S2；再取S5溶液1.00mL于25mL棕色容量瓶并用二氯甲烷定容至刻度，搖勻，即得S1。3.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇葉黃素的結(jié)構(gòu)式見下圖：圖1葉黃素結(jié)構(gòu)式葉黃素含有兩個(gè)不同的紫羅酮環(huán)：β-和ε-紫羅酮環(huán)，在各紫羅酮環(huán)的第三個(gè)碳原子上存在一個(gè)功能性羥基，為高度不飽和化合物[9]。其分子中有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，在可見光區(qū)有較強(qiáng)的吸收，未獲得最佳實(shí)驗(yàn)效果，取對(duì)照品溶液在300nm-600nm進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，葉黃素對(duì)照品在445nm附近有最大吸收峰（見圖2），故實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定波長(zhǎng)為445nm。圖2葉黃素紫外吸收光譜3.3供試品溶液的制備取同一批（201401）的越橘益視膠囊，按如下方法得到供試品溶液。供試品溶液的的制備：稱取樣品0.3g，置50ml棕色容量瓶中，精密加入5ml水溶解后，加入約40ml1%BHT丙酮，低溫超聲處理（160w，40MHz）3min，并用1%BHT丙酮定容至刻度，搖勻。取2ml至10ml容量瓶中，用1%BHT丙酮定容至刻度，搖勻，用0.45μl濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得到供試品溶液。含量為1.2mg/ml。葉黃素原料溶液的制備：取葉黃素原料（由湯臣倍健股份有限公司提供）約50mg，精密稱定，其余同上述供試品溶液的的制備方法。含量為0.2mg/ml。3.4.色譜條件 色譜柱：資生堂MGⅡ液相色譜柱（4.6mm×250mm;5μm），流動(dòng)相：甲醇:甲基叔丁基醚(85:15)，檢測(cè)波長(zhǎng)為445nm，進(jìn)樣量為10μL，柱溫為25℃，流速為0.2mL/min。3.5方法學(xué)考察3.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別將標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液（S1~S7）依次注入液相色譜儀，按3.4項(xiàng)下色譜條件，每個(gè)濃度進(jìn)樣測(cè)定1次測(cè)定，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的關(guān)系，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）得到葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=546948.7574X+79110.9032，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999，結(jié)果表明，葉黃素濃度在（0.8488μg/mL-42.4400μg/mL）范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見表4、圖3。方法檢出限按3倍信噪比在標(biāo)準(zhǔn)曲線查出所對(duì)應(yīng)的葉黃素濃度再根據(jù)計(jì)算公式中樣品在實(shí)驗(yàn)過程中的量值關(guān)系計(jì)算出本方法的檢出限為0.04974mg/kg．表4不同濃度葉黃素對(duì)照品的峰面積序號(hào)取樣量（mg)對(duì)照品含量（%）稀釋倍數(shù)濃度（μg/mL）峰面積SS121.22100125000.8488418070S250002.12201068722S21666.66676.36603412124S4100010.61005769160S550021.220011363658S6333.333331.830017409503S725042.440023143001圖3葉黃素線性范圍圖3.5.2精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液S4，按3.4項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣量6次，每次進(jìn)樣量為10μL，考察葉黃素測(cè)定結(jié)果的精密度，結(jié)果見表5。記錄其峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD=0.70%，結(jié)果表明進(jìn)樣器及色譜儀器精密度良好。表5葉黃素的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果第n次峰面積平均峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%160288595960918419920.7025985127359427424590943755963480659358633.5.3穩(wěn)定性的考察精密取同一批（120206）樣品0.2998g，按3.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法及3.4項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,考察在室溫下0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h穩(wěn)定性，連續(xù)時(shí)間內(nèi)對(duì)照品峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD是：0.90%。結(jié)果見表6，可見供試品溶液中葉黃素在12h內(nèi)含量穩(wěn)定。表6樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性時(shí)間峰面積平均面積標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%0h86283858587030769830.901h84197512h86617104h86613746h85815968h864603410h855777412h85396183.5.4重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批（201401）越橘益視膠囊樣品6份，按3.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，按上述3.4色譜條件測(cè)定，每份測(cè)兩次。測(cè)定峰面積結(jié)果如下表，計(jì)算得到葉黃素含量的RSD為2.07%。說明本方法重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表7。表7越橘益視膠囊葉黃素重現(xiàn)性結(jié)果序號(hào)樣品取樣量（g）稀釋體積(mL)實(shí)測(cè)峰面積實(shí)測(cè)濃度(μg/mL）含量（%）平均含量（%）RSD（%）10.3312250971924817.91461.35221.352.07981343318.08681.365220.3011903235816.65871.3832880993916.25211.349430.2905846492315.62131.3443860811715.88311.366940.3269972229717.92021.3705984544918.14531.387750.2998862838515.92011.3276850859615.70111.309360.2831806118614.88311.3143802554414.81791.30853.5.5葉黃素原料含量測(cè)定取葉黃素原料約50mg，精密稱定，置50ml棕色容量瓶中，精密加入溶劑5ml水溶解后，加入約40ml1%BHT丙酮，低溫超聲處理（160w，40MHz）3min，并用1%BHT丙酮定容至刻度，搖勻。取2ml至10ml容量瓶中，用1%BHT丙酮定容至刻度，搖勻，用0.45μl濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得到葉黃素原料溶液。按3.4項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣10μL，平行制備6份，每份測(cè)2次，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均含量為6.55%，RSD為0.72%。（結(jié)果見表8）表8葉黃素原料含量測(cè)定序號(hào)原料取樣量（g）稀釋體積（mL）實(shí)測(cè)峰面積實(shí)測(cè)濃度（μg/mL）含量（%）平均含量（%）RSD（%）10.05094250720187813.31206.53326.550.72719814613.30526.539820.05254746655313.79596.5645738691313.64036.495230.04914699114212.92676.5765704361213.02276.625340.05188732124513.53036.5200728665713.46706.489550.05097723288313.36876.5571721366713.33366.539960.05255756062113.96796.6451741933313.70966.52223.5.6加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品（批號(hào)：201401，葉黃素含量為1.875mg/g）18份，每份0.3g，精密稱定，平均分為三組，分別加入葉黃素原料25mg、50mg、75mg，精密稱定，其余同3.3。按3.4色譜條件進(jìn)樣10μL，每個(gè)濃度制備6份，每份測(cè)2次，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率為96.42%，RSD為3.46%，結(jié)果見表9、表10、表11。結(jié)果表明，本法具有良好的回收率，方法準(zhǔn)確、可靠。表9加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（低濃度回收）序號(hào)供試品取樣量（g）供試品含量（mg）葉黃素原料加入量（g）葉黃素原料含量（mg）實(shí)測(cè)葉黃素總量（mg）回收率（%）R10.29463.970.025951.705.6095.850.29463.970.025951.705.5592.63R20.29363.960.025461.675.5796.660.29363.960.025461.675.4991.56R30.29944.040.028801.895.8797.360.29944.040.028801.895.8696.46R40.28903.900.023981.575.3793.610.28903.900.023981.575.3693.31R50.31364.230.027881.835.9292.400.31364.230.027881.835.9694.94R60.30224.070.026141.715.6893.940.30224.070.026141.715.6290.36表10加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（中濃度回收）序號(hào)供試品取樣量（g）供試品含量（mg）葉黃素原料加入量（g）葉黃素原料含量（mg）實(shí)測(cè)葉黃素總量（mg）回收率（%）R70.31884.300.051563.387.5997.410.31884.300.051563.387.5195.10R80.31974.310.055813.667.7393.560.31974.310.055813.667.7293.19R90.29333.950.052873.467.2595.220.29333.950.052873.467.1993.55R100.30054.050.053633.517.58100.500.30054.050.053633.517.63102.00R110.29884.030.052913.477.3094.290.29884.030.052913.477.4297.94R120.30944.170.051073.357.2692.230.30944.170.051073.357.3394.42表11加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（高濃度回收）序號(hào)供試品取樣量（g）供試品含量（mg）葉黃素原料加入量（g）葉黃素原料含量（mg）實(shí)測(cè)葉黃素總量（mg）回收率（%）R130.31174.200.077025.048.9293.600.31174.200.077025.049.0195.37R140.31594.260.077095.058.9793.300.31594.260.077095.058.8691.09R150.32694.410.077995.119.55100.580.32694.410.077995.119.70103.51R160.29143.930.075734.968.6895.850.29143.930.075734.968.6394.85R170.30154.060.075084.928.5891.910.30154.060.075084.928.7394.87R180.30364.090.081965.379.4299.170.30364.090.081965.379.63103.073.5.7陰性溶液制備按越橘益視膠囊處方比例及工藝條件制備缺葉黃素原料的陰性樣品。取陰性樣品0.3g，按3.3項(xiàng)下的供試品溶液制備項(xiàng)下的方法制成供試品溶液。取對(duì)照品適量，按對(duì)照品溶液制備項(xiàng)下的方法制成對(duì)照品溶液。分別取葉黃素對(duì)照品溶液，陰性對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，可見在與葉黃素相同位置，供試品有色譜峰出現(xiàn)．陰性樣品無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性樣品無干擾。見圖4、圖5。圖4葉黃素對(duì)照品HPLC圖圖5陰性樣品HPLC圖備注：1——葉黃素3.5.8越橘益視膠囊中葉黃素含量測(cè)定分別稱取樣品（越橘益視膠囊）0.3g，精密稱定，按3.3供試品溶液的的制備方法制備，按3.4的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別進(jìn)樣供試品溶液各10μL，兩次，測(cè)定峰面積，計(jì)算越橘益視膠囊中葉黃素含量，平均含量為1.35%，結(jié)果如下（見表12）：表12越橘益視膠囊中葉黃素的含量測(cè)定序號(hào)樣品取樣量（g）稀釋體積（mL）實(shí)測(cè)峰面積實(shí)測(cè)濃度（μg/mL）含量（%）平均含量（%）RSD（%）10.3312250971924817.91461.35221.352.07981343318.08681.365220.3011903235816.65871.3832880993916.25211.349430.2905846492315.62131.3443860811715.88311.366940.3269972229717.92021.3705984544918.14531.387750.2998862838515.92011.3276850859615.70111.309360.2831806118614.88311.3143802554414.81791.30854討論4.1提取溶劑的選擇曾嘗試以三氯甲烷、二氯甲烷、水、丙酮、乙醇、50%DMSO、DMSO、正己烷、石油醚等直接溶解葉黃素原料，結(jié)果均不能使葉黃素原料溶解。后經(jīng)分析，企業(yè)所投葉黃素可能為包埋的微膠囊化葉黃素，經(jīng)查詢相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，先加少量水使微膠囊外殼的有機(jī)膜溶解，令葉黃素析出，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。通過探究和向企業(yè)核實(shí)，該樣品投料類型為原料型投料，原料含量測(cè)得平均含量為6.55%，為含量較高的有微囊包埋的顆粒。目前對(duì)葉黃素常見的提取溶劑有石油醚、氯仿、丙酮，無水乙醇等，由于丙酮提取效率高，不會(huì)對(duì)色素的性質(zhì)和質(zhì)量產(chǎn)生不良影響，又可以回收[12]，乙醇毒性低，價(jià)格低廉，故本次實(shí)驗(yàn)主要嘗試使用丙酮和無水乙醇為提取溶劑分別低溫超聲提取同一批（201401）越橘益視膠囊，并測(cè)得含量?？紤]到葉黃素在提取的過程中容易被氧化[13]，選用在提取液中加入1%BHT。因?yàn)锽HT作為一種脂溶性抗氧化劑，可以在提取時(shí)對(duì)越橘益視膠囊中的葉黃素起到保護(hù)作用[14]，避免葉黃素在提取過程中發(fā)生氧化，從而提高了葉黃素的回收率。取同一批（201401）越橘益視膠囊內(nèi)容物，按3.3項(xiàng)下方法制備，采用1%BHT無水乙醇和1%BHT丙酮超聲3min進(jìn)行提取，測(cè)得結(jié)果含量分別為1.20%和1.35%，，結(jié)合樣品越橘益視膠囊中葉黃素的投料類型分析得，提取溶劑選用1%BHT丙酮能較好地提取越橘益視膠囊中的葉黃素。（結(jié)果見表13）表13無水乙醇和1%BHT丙酮分別提取樣品中葉黃素的結(jié)果序號(hào)樣品取樣量（g）稀釋體積（mL）實(shí)測(cè)峰面積實(shí)測(cè)濃度（μg/mL）含量（%）平均含量（%）1%BHT無水乙醇-10.3112250819610714.84051.19221.201.35817636314.80441.18931%BHT無水乙醇-20.3001805759514.58731.2152804577714.56571.21341%BHT無水乙醇-30.2905766953813.87781.1943774961814.02421.20691%BHT丙酮-10.3126945202517.13671.3705951494417.25181.37971%BHT丙酮-20.2998886012916.05461.3299892219516.16801.33931%BHT丙酮-30.2831840459815.22171.3343836840815.15551.32854.2色譜條件的選擇4.2.1流動(dòng)相的選擇在高效液相色譜法測(cè)定葉黃素的流動(dòng)相系統(tǒng)中，常見的流動(dòng)相有甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲基叔丁基醚、環(huán)己烷-乙酸乙酯、甲醇-乙腈-醋酸乙酯-水等。由于葉黃素穩(wěn)定性受物理、化學(xué)及生物因素影響較大，例如光輻射、酸、高溫、堿、游離鹵素、水分狀況等，但氧是影響葉黃素穩(wěn)定性的主要因素，特別是純結(jié)晶的產(chǎn)品更容易被氧化破壞[15]，故選用甲醇-甲基叔丁基醚為流動(dòng)相，主要是甲基叔丁基醚不僅對(duì)葉黃素有較大的溶解度，而且有一個(gè)非常重要的性能，即很強(qiáng)的抗自動(dòng)氧化性，能有效地防止葉黃素在檢測(cè)過程中被氧化破壞。該體系流動(dòng)相一般能較好的分離測(cè)定葉黃素而且比較準(zhǔn)確、穩(wěn)定，線性關(guān)系良好，重現(xiàn)性好，保留時(shí)間適中，洗脫率高，不出現(xiàn)因樣品被氧化降解而產(chǎn)生的前沿峰或者拖尾峰。4.2.2流動(dòng)相比例的選擇以甲醇-甲基叔丁基醚為流動(dòng)相的體系，多數(shù)采用梯度洗脫，容易引起少部分極性比較接近葉黃素的雜質(zhì)混入葉黃素的色譜峰中從而干擾測(cè)定的結(jié)果。除此之外，每次梯度洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，平衡色譜柱也消耗較長(zhǎng)時(shí)間。本次試驗(yàn)采用等度洗脫的分離方式進(jìn)行檢測(cè)，HPLC分析時(shí)對(duì)的流動(dòng)相系統(tǒng)比例作了探索研究，由所得的色譜圖表明，以甲醇-甲基叔丁基醚（85:15，v/v）為流動(dòng)相時(shí)，保留時(shí)間適中，樣品中葉黃素峰與其他色譜峰分離效果好，峰形佳，可以消除提取液中其他組分的干擾，使葉黃素與越橘益視膠囊中其他組分得到了很好的分離（圖6、圖7、圖8、圖9）。圖6葉黃素對(duì)照品HPLC圖圖7葉黃素原料HPLC圖圖8越橘益視膠囊HPLC圖圖9陰性樣品HPLC圖備注：1——葉黃素4.2.3方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果本實(shí)驗(yàn)以現(xiàn)行的葉黃素測(cè)定國家標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，結(jié)合保健食品的性質(zhì)，研究提取方法和測(cè)定條件，該提取測(cè)定方法穩(wěn)定性強(qiáng)（在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定），重現(xiàn)性好（RSD為2.07%），回收率高，平均回收率達(dá)到96.42%。該法操作簡(jiǎn)便、快速，經(jīng)方法學(xué)考察，提取時(shí)不易發(fā)生乳化、結(jié)塊，并且檢出限低，可準(zhǔn)確地測(cè)定越橘益視膠囊中葉黃素的含量，是一種在檢測(cè)實(shí)踐中可以廣泛應(yīng)用的方法。5結(jié)論由于公司原藥品標(biāo)準(zhǔn)中沒有制定葉黃素含量測(cè)定方法，我們通過研究該樣品的制備特點(diǎn)，投料類型，選擇了高效液相色譜法測(cè)定葉黃素含量，具有快速簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可以有效地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，從而保證了產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和臨床用藥的安全性及有效性。同時(shí)也提高了越橘益視膠囊原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)中考察了提取溶劑對(duì)含量的影響，結(jié)果表明提取溶劑1%BHT丙酮對(duì)有效成分提取效果較無水乙醇好。本實(shí)驗(yàn)曾采用流動(dòng)相甲醇-甲基叔丁基醚（85:15，v/v）等度洗脫和甲醇-甲基叔丁基醚梯度洗脫，色譜峰分離效果均較理想，結(jié)果顯示，等度洗脫分離效果好，且保留時(shí)間較短，而被采用。本次試驗(yàn)，有一定的實(shí)用性，為下一步制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的參考價(jià)值。參考文獻(xiàn)[1]KijlstraA,TianY,KellyER,etal.Lutien:Morethanjustafilterforbluelight[J].ProgressinRetinalandEyeRearch,2012,31(4):03-315.[2]RenziLM,JohnsonEJ.Luteinandage-relatedoculardisordersintheolderadult:Areview[J].JournalofNutritionfortheElderly,207,26(3-4):139-157.[3]KalariyaNM,RamanaKV,VankuijkFJGM.Focusonmolecules:Lutein[J].ExperimentalEyeResearch,2011,102:107-108.[4]楊杰,高潔,方從容,等.葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性考察[J].中國食品劑,2013,6:184-189.[5]郭薇,馬福秋,崔瑞敏,等.葉黃素提取方法研究概況[J].化學(xué)與粘合,2005,27(6):377-380.[6]王麗娜,黃峻榕,張立,等.超高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中的葉黃素[J].色譜,31(12):1228-1231.[7]彭科懷,楊長(zhǎng)曉,陳曦.HPLC法測(cè)定保健食品中葉黃素的含量[J].職業(yè)衛(wèi)生與病傷,2013,28(5):287-289.[8]張志強(qiáng),唐道城,張乃湛,等.薄層掃描法測(cè)定萬壽菊中葉黃素的含量[J].化學(xué)世界,2009,9:536-539.[9]朱海霞,鄭建仙.葉黃素(Lutein)的結(jié)構(gòu)、分布、物化性質(zhì)及生理功能[J].中國食品添加劑,2005,No.5:48-55.[10]白鴻.保健食品功效成分檢測(cè)方法[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社.2012:258-270.[11]GB/T23209-2008奶粉中葉黃素的測(cè)定:液相色譜-紫外檢測(cè)法[S].[12]李永祥,劉惠君,趙林秀.從蠶沙中提取粗品葉黃素的工藝研究[J].江西化工,2004,24(2):19-20.[13]MitriK,ShegokarR,GohlaS,etal.IntJPharm,2011,420(1:):141.[14]黃百芬,鄭凱,譚瑩,等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中的葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012,22(9):2043-2045.[15]王永華,梁世中.類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)和生理功能研究[J].廣州食品工業(yè)科技,2000,(4):1-4.綜述葉黃素提取方法的研究進(jìn)展葉黃素（lutein）又名植物黃體素，是胡蘿卜素的非酸性氧衍生物，含紫羅酮環(huán)和多個(gè)不飽和雙鍵。葉黃素為3,3’-二羥基-α-胡蘿卜素[1]，分子式C40H56O2，相對(duì)分子質(zhì)量為568.85，熔點(diǎn)為190℃，不溶于水，易溶于某些有機(jī)溶劑，如氯仿、二氯甲烷、正己烷等。葉黃素在偏酸溶液、弱光和低溫下比較穩(wěn)定，在偏堿性條件下較不穩(wěn)定，在弱酸性、弱堿性條件下,發(fā)生顏色可逆變化，在強(qiáng)堿、強(qiáng)光或高溫條件下被破壞，其結(jié)構(gòu)如下:純的葉黃素為棱格狀黃色晶體，有金屬光澤，熔點(diǎn)為183℃~190℃，對(duì)光和氧不穩(wěn)定，需貯存于陰涼干燥處，避光密封保存[2]。葉黃素在甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、菠菜等深綠色葉菜及金盞花、萬壽菊等花卉中含量最高，其次，南瓜、桃子、辣椒、芒果、柑橘中含有豐富的“葉黃素酯”。葉黃素是構(gòu)成人眼視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的主要色素，對(duì)維持眼部健康有一定作用。此外，大量研究發(fā)現(xiàn)葉黃素對(duì)心血管疾病、癌癥、糖尿病等多種慢性疾病有一定預(yù)防和改善作用。鑒于葉黃素?zé)o毒安全，具有較強(qiáng)抗氧化、改善視力等生理功能，已被作為食品補(bǔ)充劑允許在食品、飲料、化妝品、保健食品，甚至嬰幼兒食品中添加。1葉黃素的提取方法綜述1.1超臨界CO2流體萃取法超臨界CO2流體萃取技術(shù)是食品工業(yè)新興的一項(xiàng)萃取和分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的有機(jī)試劑法相比，采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品無溶劑殘留、無污染，可避免萃取物在高溫下的熱劣化。保護(hù)生理活性物質(zhì)的活性，保持萃取物的天然風(fēng)味等。目前超臨界CO2流體萃取技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用到辣椒紅素、番茄紅素、β-胡蘿卜素和梔子黃色素等天然食用色素的萃取和精制中[3-6]。徐如平等通過改變萃取溫度、時(shí)間、壓力、CO2流量等條件萬壽菊干花粉葉黃素提取率的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：萃取時(shí)間為3h，溫度55℃，萃取壓力25MPa，CO2流量10L/h，分離罐I溫度42℃，壓力11MPa，分離罐Ⅱ溫度38℃，壓力同儲(chǔ)罐，為萬壽菊葉黃素的最佳提取條件。1.2有機(jī)溶劑萃取法葉黃素的萃取效果主要受原料顆粒的大小、萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取劑的種類和萃取劑流量大小等因素的影響。目前常用的提取劑有正己烷、石油醚、丙酮、乙醇、四氫呋喃、氯仿、6#溶劑油等，以6#溶劑油、氯仿和四氫呋哺的提取效果較好[7]。夏樹林等[8]研究了從萬壽菊花提取葉黃素的工藝條件，結(jié)果顯示，將萬壽菊花、四氫呋喃、乙醇、水和K0H在室溫下混合，同時(shí)進(jìn)行萃取和皂化處理的工藝流程最佳。采用該工藝所得的葉黃素的純度可達(dá)97.6%以上。崔振海等[9]通過改變?nèi)軇┓N類、提取時(shí)間等條件對(duì)萬壽菊干花粉葉黃素提取率的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：浸提溶劑采用氯仿-乙醇以3:2的體積比混合，浸提次數(shù)2次，物料比1:10浸提時(shí)間，每次的浸提時(shí)間為2h，皂化時(shí)NaOH的濃度5%，皂化時(shí)間8h，為萬壽菊葉黃素的最佳提取條件。1.3循環(huán)超聲提取法超聲波提取是目前國內(nèi)外正在研究開發(fā)的一種輔助溶劑提取技術(shù)，它的優(yōu)點(diǎn)是提取速度快、效率高、溶劑用量少等。采用超聲波法從植物中提取天然活性物質(zhì)，在提取過程中將細(xì)胞破碎使被提取物能夠快速、高效地進(jìn)入提取介質(zhì)，縮短捉取時(shí)間，增加提取效率。而沒有超聲輔助的普通靜態(tài)溶劑提取法的主要問題是提取時(shí)間長(zhǎng)，溶劑用量大，在研究中為了了解萬壽菊中自然存存及加工中每種類胡蘿卜素對(duì)應(yīng)的真實(shí)含量，必須要有較高的提取率來保證后續(xù)研究的準(zhǔn)確性，所以靜態(tài)溶劑提取法經(jīng)常要多次離心多次和更新溶劑以獲得較高的提取效率，而循環(huán)超聲捉取法的優(yōu)點(diǎn)是不僅節(jié)約溶劑用量而且大大降低了捉取時(shí)問，提高了提取效率，同時(shí)降低了后續(xù)濃縮而造成類胡蘿卜素降解的可能性。王靜鈺等[10]采用循環(huán)超聲技術(shù)，用石油醚和丙酮混合溶劑從萬壽菊造粒中提取葉黃素，探討獲得循環(huán)超聲提取的理想工藝參數(shù)，在結(jié)果顯示，提取溶劑為丙酮:石油醚=1:1(V/V)，在超聲波功率800W、超聲波作用時(shí)間為20min，料液比1:70時(shí)，可以得到較好的提取效果。2葉黃素常見的分析方法綜述2.1高效液相色譜法目前，葉黃素的主要分析方法是高效液相色譜法(HPLC)，特別是在定性、定量分析不同極性類胡蘿卜素時(shí)此法成為首選方法。HPLC可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物中葉黃素的定性定量分析，用葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品建立峰面積和濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的出峰時(shí)間和峰面積，確定葉黃素的組成和含量。目前，國內(nèi)外在HPLC分離多種類胡蘿卜素方面已經(jīng)進(jìn)行了一定的研究，主要在于該方法具有高效，準(zhǔn)確，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。2.2薄層掃描法薄層色譜法是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也用于跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。與HPLC相比，TLC適應(yīng)性更強(qiáng)且操作簡(jiǎn)單。TLC有更多可選擇的溶劑用于流動(dòng)相，而且可以同時(shí)分離幾個(gè)樣品。分析含有葉黃素的復(fù)雜樣品時(shí)，將TLC和HPLC結(jié)合起來，能夠得到更好的效果。Hodisan[11]等人在分析薔薇過時(shí)的類胡蘿卜素的組成的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)了用薄層掃面法和高效液相法可得到基本型相同的定性分析結(jié)果，以此表明TLC是一種有效快速的定性類胡蘿卜素的方法，2.3紫外-可見分光光度法紫外-可見分光光度法具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，儀器價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，成為一種定量分析的檢測(cè)方法。葉黃素分子結(jié)構(gòu)中具有共軛雙鍵體系，在可見光區(qū)