SDSPAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳詳解

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-Polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS現(xiàn)在是1頁\一共有65頁\編輯于星期一一、什么是SDS？十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS)是一種陰離子去污劑。它在水溶液中以單體（monomer）和分子團(tuán)（micellae）的混合形式存在。現(xiàn)在是2頁\一共有65頁\編輯于星期一SDS的作用

破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變原有的構(gòu)象，保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。現(xiàn)在是3頁\一共有65頁\編輯于星期一二、SDS的基本原理（一）蛋白質(zhì)分子的解聚

樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略?，F(xiàn)在是4頁\一共有65頁\編輯于星期一1、SDS

陰離子去污劑

變性劑

助溶性試劑

斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵

分子去折疊

破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)

現(xiàn)在是5頁\一共有65頁\編輯于星期一2、強還原劑

巰基乙醇（β-mercaptoethanal）

二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）

使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂?，F(xiàn)在是6頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是7頁\一共有65頁\編輯于星期一SDS和還原劑的作用：

（1）分子被解聚或組成它們的多肽鍵

（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)

電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。

（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超

過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除

了不同分子之間原有的電荷差異。現(xiàn)在是8頁\一共有65頁\編輯于星期一蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點

（1）形狀像一個長橢圓棒

（2）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的。

（3）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比?，F(xiàn)在是9頁\一共有65頁\編輯于星期一膠束在SDS系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD—200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系現(xiàn)在是10頁\一共有65頁\編輯于星期一3、影響SDS電泳的關(guān)鍵因素

（1）溶液中SDS單體濃度（>1mmol/L)

大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1：1.4

（2）樣品緩沖液的離子強度（不>0.26)

低離子強度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。

現(xiàn)在是11頁\一共有65頁\編輯于星期一（3）二硫鍵是否完全被還原

當(dāng)二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關(guān)系?，F(xiàn)在是12頁\一共有65頁\編輯于星期一（二）緩沖系統(tǒng)的選擇

一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。

現(xiàn)在是13頁\一共有65頁\編輯于星期一電泳緩沖液的種類：

1、磷酸緩沖液

2、Tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng)

3、咪唑緩沖液系統(tǒng)：

比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低，電泳速

度要比后者快一倍。

4、尿素系統(tǒng)：

適用分子量低于15KD的蛋白樣品。

5、Tris-甘氨酸系統(tǒng)：

使用最多的緩沖液

6、Tris-硼酸鹽緩沖液：

測定糖蛋白的分子量

現(xiàn)在是14頁\一共有65頁\編輯于星期一（三）凝膠濃度的選擇

由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇會直接影響分辨率。

不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度.

現(xiàn)在是15頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是16頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是17頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是18頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是19頁\一共有65頁\編輯于星期一（四）分子量測定

1、相對遷移率（Rf）

Rf即用每個帶的遷移距離除以溴酚藍(lán)前沿的遷移距離得到的。

測量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。

蛋白帶遷移距離

Rf=————————

溴酚藍(lán)遷移距離

現(xiàn)在是20頁\一共有65頁\編輯于星期一蛋白帶遷移距離固定前的凝膠長度

Rf=—————————X—————————

干燥后的凝膠長度溴酚藍(lán)遷移距離

現(xiàn)在是21頁\一共有65頁\編輯于星期一2、作圖

以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對數(shù)值為縱坐標(biāo)，Rf為橫坐標(biāo)繪圖現(xiàn)在是22頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是23頁\一共有65頁\編輯于星期一3、通過測定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標(biāo)

準(zhǔn)曲線上讀出他的分子量

現(xiàn)在是24頁\一共有65頁\編輯于星期一三、去污劑的選擇

無離子去污劑：LubroW；Brij35，Tween

Triton

陽離子去污劑：cetyltrimethylammonium

bromide（CTAB）

cetylpyyridinium（CPC）

陰離子去污劑：SDSdeoxycholate

現(xiàn)在是25頁\一共有65頁\編輯于星期一四、方法

1、分類

（1）根據(jù)對樣品的處理方式的不同

還原SDS電泳

非還原SDS電泳

帶有烷基化作用的還原SDS電泳

現(xiàn)在是26頁\一共有65頁\編輯于星期一（2）根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同

連續(xù)電泳

不連續(xù)電泳

（3）根據(jù)電泳的形式

圓盤電泳

垂直電泳

平板電泳

水平電泳

現(xiàn)在是27頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是28頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是29頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是30頁\一共有65頁\編輯于星期一2、操作

（1）制備分離膠

（2）制備積層膠(堆積膠）現(xiàn)在是31頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是32頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是33頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是34頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是35頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是36頁\一共有65頁\編輯于星期一分離膠聚合之后現(xiàn)在是37頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是38頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是39頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是40頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是41頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是42頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是43頁\一共有65頁\編輯于星期一（3）加樣品

樣品的處理

在蛋白溶液中加入過量的SDS后，可引起以下的反應(yīng)：

蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽

氫鍵斷裂

疏水相互作用被取消

多肽被去折疊(二級結(jié)構(gòu)破壞),并形成橢球形現(xiàn)在是44頁\一共有65頁\編輯于星期一①還原SDS處理

當(dāng)加入還原試劑DTT或β-二巰基乙醇后，蛋白質(zhì)被完全去折疊，只根據(jù)分子量分離?，F(xiàn)在是45頁\一共有65頁\編輯于星期一②帶有烷基化作用的還原SDS處理

烷基化作用可以很好地并經(jīng)久牢固地保護(hù)SH基團(tuán)，而得到窄的電泳帶。

現(xiàn)在是46頁\一共有65頁\編輯于星期一③非還原的SDS處理

許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分鐘，并不需要加還原劑，此時二硫鍵不能被斷裂，蛋白并沒有完全被去折疊。

現(xiàn)在是47頁\一共有65頁\編輯于星期一（4）電泳（5）固定

現(xiàn)在是48頁\一共有65頁\編輯于星期一（6）染色

考馬斯亮藍(lán)（coomassiebrilliantblue）

①R-250

三苯基甲烷，紅藍(lán)色，每個分子含有兩個SO3H基團(tuán)，偏酸性，和氨基黑一樣也是結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上。

現(xiàn)在是49頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是50頁\一共有65頁\編輯于星期一②G-250

二甲花青亮藍(lán)，藍(lán)綠色?，F(xiàn)在是51頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是52頁\一共有65頁\編輯于星期一銀染色

銀染的機制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。

現(xiàn)在是53頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是54頁\一共有65頁\編輯于星期一（7）照相，凝膠干燥（8）定量測定

現(xiàn)在是55頁\一共有65頁\編輯于星期一3、電泳過程中的不正常現(xiàn)象

（1）“微笑”現(xiàn)象

指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好?，F(xiàn)在是56頁\一共有65頁\編輯于星期一（2）“皺眉”現(xiàn)象

由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。

現(xiàn)在是57頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是58頁\一共有65頁\編輯于星期一（3）“拖尾”現(xiàn)象

樣品溶解不佳引起。現(xiàn)在是59頁\一共有65頁\編輯于星期一（4）“紋理”現(xiàn)象

由于樣品中的不溶顆粒引起的?，F(xiàn)在是60頁\一共有65頁\編輯于星期一（5）偏斜現(xiàn)象

電極放置不平行引起或加樣位置偏斜而引起現(xiàn)在是61頁\一共有65頁\編輯于星期一（6）帶太寬

加樣量太多或加樣孔泄漏引起現(xiàn)在是62頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是63頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是64頁\一共有65頁\編輯于星期一MolecularmassversusmolecularweightMolecularmass(symbolm)isexpressedinDaltons(Da).OneDaltonisdefinedas1/12themassofcarbon12.MostmacromoleculesarelargeenoughtousethekiloDalton(kDa)todescribemolecularmass.Molecularweightisnotthesameasmolecularmass.Itisalsoknownasrelativemolecularmass(symbolMr,whererisasubscript).Molecularweightisdefinedastheratioofthemassofamacromoleculeto1/12themassofacarbon12atom.Itisadimensionlessquantity.WhentheliteraturegivesamassinDaorkDaitreferstomolecularmass.It