臨床基因擴(kuò)增(PCR)診斷實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范

附件2臨床基因擴(kuò)增（）斷實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范（試行）為使基因擴(kuò)增診斷技術(shù)規(guī)范有效的用于臨床證檢測質(zhì)量好地為臨床疾病的診療服務(wù)，特制定本規(guī)范。．臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置：和儀器設(shè)備臨床PCR實(shí)室分為四個(gè)隔開的工作區(qū)域，每一區(qū)域都應(yīng)有專用的儀器設(shè)備。1試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)2本制備區(qū)擴(kuò)增反混合物配制和擴(kuò)增區(qū)和的擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測同時(shí)完成的熒光定量方或全自動(dòng)分析儀如Cobas－（Anplicor等，則）和4）個(gè)區(qū)可合并。與上述特定實(shí)驗(yàn)區(qū)有關(guān)的各個(gè)房間必須有明確的標(biāo)記免不同工作區(qū)內(nèi)的設(shè)備物品如加樣器、試劑等的移出或不同的工作區(qū)間發(fā)生混淆。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)必須遵循一嚴(yán)格的）順序只能按單一方向進(jìn)行從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)～標(biāo)本制備區(qū)～擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)～擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)必須使用不同的工作服，可以不同的顏色來區(qū)別。此外，當(dāng)工作人員離開各工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。．l．試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)本區(qū)用于貯存溶液的制條液分裝和主反應(yīng)混合液的制各區(qū)器設(shè)備配置冰和一20冰柜）混勻器）微量加樣器若干支（覆蓋～用工作服和工作鞋）專用辦公用品）消耗品：一性套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離。心管和加樣器吸頭（帶濾心移紫外燈（近工作臺(tái)面．．標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本貯存、核酸提取及貯存均在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行RNA測時(shí)單鍵cDNA合成也在本區(qū)進(jìn)行。本區(qū)儀器設(shè)備自己置l4冰、20或-70冰柜三（）高達(dá)臺(tái)式冷凍離心機(jī)）勻）水浴箱或加熱模塊）微量如排器若干支（覆蓋l～μl專用工作服和工作鞋專用辦公用品）消耗品：一性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心移紫外燈（近工作臺(tái)面超凈工作臺(tái)11）超聲波?。ㄌ幚泶蠓肿覦NA適．．?dāng)U增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)模板材料（來自標(biāo)本制備區(qū)）和主反應(yīng)混合自劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)）的加入以及擴(kuò)增反應(yīng)等專門在本二．作區(qū)內(nèi)近行。本區(qū)儀器設(shè)備自己置）核酸擴(kuò)增僅三（）微量加樣器（覆蓋1μl用作服和工作鞋專用辦公用品消耗品一次性手套、一次性吸水紙、高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面．4.擴(kuò)產(chǎn)物分析區(qū)本區(qū)面積應(yīng)為～8m。擴(kuò)增物的分析在本區(qū)進(jìn)行。本區(qū)儀器設(shè)備配置：視檢測方法不同而定，如為，則需l微量加樣器若干支（覆蓋l～2s（）酶標(biāo)權(quán)、洗報(bào)機(jī)和恒溫箱（）專用工作服和工作鞋）專用辦么，用品）消耗品～次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心移紫外燈（近工作臺(tái)面

．臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢測的所有階段定分析前的標(biāo)本來集處理、測定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報(bào)告等。．．標(biāo)本的采集常用于基因擴(kuò)增檢測的臨床標(biāo)本包括EDTA或檬酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿．痰、腦普液、尿及分泌物等。采樣容器最好是密閉的一次性的，如真空系血管。一次性塑料容器使用時(shí)無需進(jìn)一步預(yù)處理用非密鬧采樣系統(tǒng)時(shí)尿泌和骨髓的采禪，必須注意防止來自來樣者的皮屑或分泌物的污染樣者采樣時(shí)起碼要談一性手套可重復(fù)使用的玻璃〔高壓處理因?yàn)椴ＡВǔ：胁灰资Щ畹腁NA酶酶主要來源是實(shí)驗(yàn)人員的手。最好是熱滅菌，烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶久性失活。全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。通常EDTA和拘檬酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝因肝素是Taq酶強(qiáng)抑制劑而在其后的核酸提取步驟中很難去除肝素臨床用于RNA如HCVRNA測定的血標(biāo)本最好進(jìn)行抗凝處理并盡（小時(shí)以內(nèi)分離血漿，以避免RNA的解。如未作抗凝處理，則物血后，必須在時(shí)內(nèi)分離血清。．．標(biāo)本的穩(wěn)定化處分，標(biāo)本采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室。由于RNA易降解此于RNA定的標(biāo)本的穩(wěn)定化處理有時(shí)是必不可少的，物質(zhì)[特別是異硫氨酸抓thiocyanateGITC可RNAse立失活。在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿加入含有GITC的劑管中進(jìn)行穩(wěn)定化處理。GITC可使RNAse不逆失活的適合濃度為5mol/L如果濃小于／LRNA會(huì)很快降解。在適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。如果溫度低于室溫，GITC即結(jié)晶，所以在加入標(biāo)本前應(yīng)使之完全溶解。如標(biāo)本不能及時(shí)送到驗(yàn)室，最好選用GITC處方法以穩(wěn)定標(biāo)本。．標(biāo)本的運(yùn)送標(biāo)本來集后應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過郵寄運(yùn)送。如用于提取的含EDTA的血標(biāo)本及用于RNA提取的經(jīng)GITC穩(wěn)化處理的標(biāo)本是冷藏取決于標(biāo)本的用途長時(shí)間在室溫貯存會(huì)導(dǎo)致靈敏度大大降低通常應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本于RNA測的標(biāo)本果在未經(jīng)穩(wěn)定化處理則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。．．標(biāo)本的貯存臨床體液標(biāo)本如血清／血漿等可-70下長時(shí)間貯存。用于測的核酸樣本應(yīng)在10mmolLTrislmmolLEDTA緩沖液．58．0）中保。用于定的核酸樣本應(yīng)在緩沖液中一C或氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在一即可。用GIT：穩(wěn)定化處理的RNA標(biāo)在室溫可保存7天，如貯存時(shí)間較長，則NA定敏感性略有下降。．．標(biāo)本的處理（核酸提?。┖怂崽崛∈菦Q定擴(kuò)增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟常酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致抑物可能來源于標(biāo)本如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物核酸提取過程中確．留的有機(jī)溶劑（如酚、氯份等些物質(zhì)對其后的酶反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，

從而影響靶核酸的擴(kuò)增測定。如在測定中。采用對血清杯水煮沸裂解以釋放DNA方法時(shí)，肉眼觀察不明顯的溶血也會(huì)對擴(kuò)增測定有很強(qiáng)的抑制作用，應(yīng)使用正規(guī)的核酸提取方法（如經(jīng)典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等標(biāo)本為疾時(shí)，則必須先進(jìn)行液化處理。再提取核酸。需注意的是；液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過長。此外，當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，降解是一個(gè)主要問題。RT－定失敗的常見原因是標(biāo)本在運(yùn)送前來經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理．及核酸提取試劑的RNase的染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果沒．現(xiàn)RNA降的證據(jù)。實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。對于后者，建議常規(guī)使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。．靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增．6.l靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄cDNA合為中的第一個(gè)酶反應(yīng)步驟所生的cDNA為RNA的向互補(bǔ)鏈。為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常影響cDNA合的效率：lRT活性的降低或完全缺乏。必須排除由于酶量不高、試劑降解或加樣錯(cuò)誤而引起的cDNA成不充分。）或穩(wěn)定聚合酶的抑制物（如酚、血紅素RNA明顯為完整而沒有擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)懷疑有此類抑制物。）RNA的解。．．2影擴(kuò)增的因素有多種因素可引起PCR的陽性或假陰性結(jié)，如抑制劑或酶活性喪見上溫度不對十濃度不佳者標(biāo)本或試劑受污染等應(yīng)孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，循環(huán)儀的溫度控制和加熱塊中熱傳導(dǎo)的一致性必須有常規(guī)的檢查以避免假陰性結(jié)果。．污染在實(shí)際工作中，常見有以下幾種污染類型：片段的污染（產(chǎn)物污染）三天然基因組的染；試劑污染（貯存液或工作液及及污染（如氣溶膠從一個(gè)陽性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本于有的擴(kuò)增技術(shù)，由于圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不僅耗時(shí)而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。一旦發(fā)生了污染就必須停止直發(fā)現(xiàn)了污染源為止如果沒有例外實(shí)驗(yàn)結(jié)必須作廢使平行的污染質(zhì)控中僅有一管顯示出有片段污染。．．l．測定分析前的污染源。測定分析前實(shí)驗(yàn)材料的污染主要來自非病人標(biāo)本來源的核酸。．．2．測定分析階段的污染源。通常測定分析階段的每一步都能發(fā)生對樣本的污染應(yīng)合液的任何成分及核酸的制備和反應(yīng)建立階段所涉及到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的任何部位都是可能的污染源污染的試劑（例如今血清白蛋白，明腋成礦物油品制劑；消耗品（如反應(yīng)管，吸頭）和實(shí)驗(yàn)設(shè)備（如加樣器、離心機(jī)染來源之一是許多樣本在同時(shí)制備時(shí)的交及污染，但最主要的污染來源為以前擴(kuò)增產(chǎn)生的特異產(chǎn)物DNA片段。在前面三個(gè)工作區(qū)中，當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作

會(huì)引起所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒?yàn)設(shè)備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取PCR產(chǎn)用于檢測時(shí)，非常容易引起污染，因此必須制定并嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作程序。．．3．污染的避免。要避免污染先是預(yù)防而不排除污染面所述工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的正是為了預(yù)防污染為避免以前測定中產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染設(shè)法將其破壞掉如擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取部分：而產(chǎn)生特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖激酶UNG破壞來自以前測定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對將要進(jìn)行的擴(kuò)增測定的污染另外一種法是持續(xù)的長波紫外燈照射通過異補(bǔ)骨脂素光化單產(chǎn)生DNA合物，由于加物對擴(kuò)增沒有反應(yīng)但又不妨礙PCR后交程，所以這些方法也能防止污染于上面提到的方法會(huì)給人一種假的安全感以不能以其來替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴(kuò)增的天然的染．．4．去除污染的措施。工作完后必須定期采取有效的去污染措施合各種不同的方法可達(dá)到最佳效果污染措施包括但不僅限下面幾種：用／L次氨鈉清潔表面；試驗(yàn)了后長時(shí)間的紫外照射實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)和其他表面；實(shí)驗(yàn)設(shè)備如加樣器的高壓消毒。．．?dāng)U增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的測定有各種方法。如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、雜交、測序、分光光度法定量等。但臨床PCR測定項(xiàng)目本上都使用探針雜交方法。．．l．與雜交檢測有關(guān)的干擾。雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適記方法不對對探針的標(biāo)記不夠雜交或洗滌方法不合適。最常使用的基因探針有片段、合成的尊核普酸和體外的轉(zhuǎn)錄本（反義RNA探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光景和同位素等。在擴(kuò)增后的雜交檢測中該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件度太低或離子強(qiáng)度太高都會(huì)降低雜交的嚴(yán)格性會(huì)給檢測信號的特異性帶來負(fù)面影響相反提潤度和／或降低離子強(qiáng)度會(huì)增加雜交的嚴(yán)格性此嚴(yán)密控制溫度和試劑是避免假陽性和假陰性結(jié)果的先決條件，要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)改變。．．質(zhì)量控制如上所述，應(yīng)該開展各種質(zhì)控來評價(jià)測定分析當(dāng)中各步驟的質(zhì)量，如RNA的整性、對擴(kuò)增是否合適和敏感。．．1．室內(nèi)質(zhì)量控制必須對DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避假陽性和假陰性，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于PCR測的高敏感性，所以試劑的生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備本身和實(shí)驗(yàn)中的每一步都要求有質(zhì)控增應(yīng)前后的酶反應(yīng)各步也應(yīng)有質(zhì)控不在質(zhì)控細(xì)節(jié)上稍有不同。．．1．1．與實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備有關(guān)的質(zhì)。對提取試劑的效果最常用球脂糖凝膠電冰來檢測?？芍崛〉氖欠癜l(fā)生降解用規(guī)的手工提取方法制的DNA的均長度一般為100kb用適合PCR的

提取試劑盒制備的DNA的度平均范圍為30�40kb然而；明顯出現(xiàn)降解的（和10kb的低分子量范圍內(nèi)）在經(jīng)瓊脂糖凝膠電分離和用溴化乙錠染色后也可見有強(qiáng)的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI）消化，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M(jìn)行質(zhì)控（在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切的抑制劑的存在通常用260nm和的分光光度測定來估計(jì)，好的提取物，比應(yīng)該在1．75--20之；否則，污染（殘留的蛋白或酚）可能會(huì)很高。僅用光度計(jì)比色方法不能對的完整性下結(jié)論。最快的對總RNA提質(zhì)控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電冰，這一點(diǎn)跟分相同，然而，如果對結(jié)果產(chǎn)生懷疑，就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下，三種主要的核糖體、和5S）凝膠上出現(xiàn)的帶相對較窄。如發(fā)生RNA降解。則帶被拖向低分子量或出現(xiàn)帶的缺失。測定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對RNA制的質(zhì)量評價(jià)的實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的備中被污的程度由這些原因單獨(dú)的光電比色不能對的整性下結(jié)論。．．1．2．對合和擴(kuò)增的質(zhì)控。本部分包括陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。．l．2lcDNA的合成。對CDNA合成的效率進(jìn)行監(jiān)控的關(guān)鍵性的質(zhì)控是使用一個(gè)內(nèi)反應(yīng)質(zhì)控的成可以從存在子每一個(gè)RNA提取物中的cRNA轉(zhuǎn)錄本開始(即普遍表達(dá)的，如核糖體蛋白轉(zhuǎn)錄本這一類的所謂的管家基因也可從在制備時(shí)加入樣本中的作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的RNA開始cDNA合成的內(nèi)質(zhì)控是能夠產(chǎn)生定產(chǎn)物的陽性質(zhì)控；如果擴(kuò)增不成功，質(zhì)控就顯示出有RNA的解cDNA合的過程中錯(cuò)誤啟動(dòng)或酶活性喪失。加入確定量的擴(kuò)增質(zhì)控物可以檢測RT�PCR的敏度對于RT－方所必的污染質(zhì)控為無逆轉(zhuǎn)錄靶RNA的性質(zhì)控。．．1．2．．應(yīng)。內(nèi)反應(yīng)質(zhì)控是陽性質(zhì)控可使用對有機(jī)體存活所必須的靶基因作質(zhì)按些基因至少以豐臺(tái)子狀態(tài)存在，因?yàn)槿绻蚪M缺失這些基因，將使有機(jī)體致死（所謂的致死因子個(gè)比較好的例子就是維生素血結(jié)合蛋白的基因；在世界范圍內(nèi)的許多種族已發(fā)現(xiàn)其廣泛的多態(tài)性，并且還沒有發(fā)現(xiàn)基因活性的同源性丟失，因此，通過PCR共擴(kuò)增這種基因的一個(gè)片段，在所有患者中均可獲得成功，并且也會(huì)證明擴(kuò)增反應(yīng)是成功的。在測定血清／血漿病原體核酸如HBVDNA、HCVRNA等，應(yīng)使用已知的弱陽性血清／血漿作為質(zhì)控樣本持測臨床標(biāo)本等同處理提取核酸及擴(kuò)增判擴(kuò)增檢測的有效性