細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程

細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程第1頁/共58頁第一節(jié)DNA的重組和重組DNA技術(shù)一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件二、重組DNA技術(shù)的主要內(nèi)容或步驟三、重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理1．PCR2．核酸的凝膠電泳(Agarose&Polyacrylamide)3．核酸的分子雜交技術(shù)4．基因的定點(diǎn)誘變（site-directedmutagenesis）5.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”6．DNA連接酶——“分子縫合針”7．基因的載體——“分子運(yùn)輸車”8．細(xì)菌的轉(zhuǎn)化第2頁/共58頁Section1

DNArecombination

DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生的遺傳信息的重新共價組合過程。包括同源重組、特異位點(diǎn)重組和轉(zhuǎn)座重組等類型，廣泛存在于各類生物。體外通過人工DNA重組可獲得重組體DNA，是基因工程中的關(guān)鍵步驟。第3頁/共58頁Section1RecombinationDNAtechnicalnameGeneSplicing

/DNArecombinationoperatingenvironmentInvitro（細(xì)胞體外）Manipulateobjects

geneOperationallevel

MolecularDNABasicprocess剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)result人類需要的基因產(chǎn)物第4頁/共58頁一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識了遺傳信息的流動和表達(dá)。第5頁/共58頁年份事件1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T.Avery證實DNA是遺傳物質(zhì)。1952A.D.Hershey和M.Chase再次證實噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。1959-1960S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。第6頁/共58頁年份事件1964C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965S.W.Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由"質(zhì)粒"DNA所決定。1966M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。1975-1977F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。第7頁/共58頁年份事件1978首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。1980美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。1983獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。第8頁/共58頁年份事件1986GMO首次在環(huán)境中釋放。1988J.D.Watson出任"人類基因組計劃"首席科學(xué)家。1992歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定(315kb)1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。第9頁/共58頁二、重組DNA技術(shù)的主要內(nèi)容或步驟1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱宿主細(xì)胞）并與之一起增殖。4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。第10頁/共58頁第11頁/共58頁三、重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

1．PCR①穆里斯等人于1988年發(fā)明的，1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎。在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。②目的：獲取大量的目的基因。③原理：DNA復(fù)制。④條件：已知目的基因的核苷酸序列即模板DNA、RNA引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）、離子。⑤方法：DNA受熱變性解旋為單鏈、冷卻后RNA引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、DNA聚合酶作用下延伸合成互補(bǔ)鏈。⑥特點(diǎn)：指數(shù)擴(kuò)增=2n（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑦過程：變性、退火、延伸、重復(fù)四個過程。第12頁/共58頁重組DNA技術(shù)的

主要技術(shù)原理

1．PCR步驟名稱需要的溫度過程第一步變性90～95℃將反應(yīng)體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸以及酶促反應(yīng)所需要的離子等）加熱至90～95℃，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開，變成單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板。第二步復(fù)性55～60℃將反應(yīng)體系降溫至55～60℃，使兩種引物分別與模板DNA鏈3＇'端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對，這個過程稱為復(fù)性。第三步延伸合成70～75℃將反應(yīng)體系升溫至70～75℃，在耐高溫的DNA聚合酶的催化作用下，將與模板互補(bǔ)的單個核苷酸加到引物所提供的3＇-OH上，使DNA鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈。第13頁/共58頁重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

2．核酸的凝膠電泳(Agarose&Polyacrylamide)電泳的速率，與電場強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。電泳的方向：DNA和RNA呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負(fù)極→正極移動。染色：ethidiumbromide染色，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。第14頁/共58頁第15頁/共58頁重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

3．核酸的分子雜交技術(shù)核酸印跡(nucleicacidblotting)轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colonyandplaqueblotting)；核酸雜交/印跡雜交：將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。第16頁/共58頁第17頁/共58頁重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

4．基因的定點(diǎn)誘變（site-directedmutagenesis）基因或DNA片段中的任何一個特定堿基發(fā)生取代、插入或缺失變化的過程a.盒式誘變(cassettemutagenesis)b．寡核苷酸引物誘變c．PCRG與PCR誘變第18頁/共58頁5．限制性酶切-“分子手術(shù)刀”restrictionendonuclease:在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。Ⅰ型：既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；Ⅱ型：只催化非甲基化的DNA的水解。重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

4.36kp第19頁/共58頁5.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”

主要來源：原核生物（300種原核生物中分離出了約4000種限制酶）特點(diǎn)：具有專一性作用：斷裂特定部位兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。產(chǎn)物：用限制性核酸內(nèi)切酶切割形成的末端有兩種：即黏性末端和平末端。①黏性末端：是限制酶在識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開形成的。②平末端：是限制酶在識別序列的中心軸線處切開形成的。第20頁/共58頁題.下列關(guān)于基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的描述，錯誤的是A.一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列B.限制性核酸內(nèi)切酶的活性受溫度影響C.限制性核酸內(nèi)切酶能識別和切割RNAD.限制性核酸內(nèi)切酶可以從原核生物中提取第21頁/共58頁6．DNA連接酶——“分子縫合針”作用：恢復(fù)被限制酶切開了的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。種類⑴E.coliDNA連接酶：只能縫合雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，而不能將雙鏈DNA平末端進(jìn)行連接。⑵T4DNA連接酶：既可縫合DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可縫合雙鏈DNA片段的平末端。但連接平末端之間的效率比較低。重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

第22頁/共58頁6．DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶和DNA聚合酶的比較:

DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈雙鏈單鏈連接部位在兩DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸加到已存在的核酸片段的3’端的羥基上，形成磷酸二酯鍵重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

第23頁/共58頁7．基因的載體——“分子運(yùn)輸車”作用：是基因運(yùn)輸?shù)墓ぞ?一是用它作為運(yùn)載工具，將目的基因送到宿主細(xì)胞中去；二是利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。條件①能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制；②有一個至多個限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；③具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選。重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

第24頁/共58頁7．基因的載體——“分子運(yùn)輸車”種類：目前，基因工程經(jīng)常使用的載體主要有以下幾類：⑴細(xì)菌的質(zhì)粒：最常用的載體。⑵噬菌體⑶動植物病毒它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制以及插入片段大小上也有很大差別重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

第25頁/共58頁8．細(xì)菌的轉(zhuǎn)化一細(xì)菌菌株捕獲另一細(xì)菌菌株的DNA，導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變供體菌株–受體菌株大腸桿菌是最廣泛使用的實驗菌株CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使之呈感受態(tài)（CompetentCells）每μgDNA可得107-108個轉(zhuǎn)化子重組DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理

第26頁/共58頁第27頁/共58頁小結(jié)1、限制性內(nèi)切酶：來源、功能、作用特點(diǎn)第28頁/共58頁第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序（一）第一步——目的基因的獲取1.目的基因2.獲取目的基因的方法（1）從基因文庫中獲取目的基因①基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。②目的基因的獲取根據(jù)基因的有關(guān)信息：基因的脫氧核苷酸序列、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA、基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性獲取目的基因。優(yōu)點(diǎn)：有了基因文庫，就可隨時從中提取所需要的目的基因，引入受體細(xì)胞使之表達(dá)。第29頁/共58頁第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序（一）第一步——目的基因的獲取1.目的基因2.獲取目的基因的方法（2）人工合成法：如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學(xué)方法人工合成。①反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。②人工合成：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列通過化學(xué)方法合成目的基因。如人的血紅蛋白基因、胰島素基因。（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。第30頁/共58頁第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序（二）第二步---基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.目的：使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2.表達(dá)載體的組成：①啟動子：②終止子：③標(biāo)記基因：基因表達(dá)載體模式圖第31頁/共58頁第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序（二）第二步---基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、構(gòu)建步驟①酶切質(zhì)粒②用同種限制酶切割目的基因③適量的DNA連接酶，結(jié)合成重組質(zhì)粒。第32頁/共58頁第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化：2、方法：受體種類不同，導(dǎo)入的方法不同。（1）導(dǎo)入植物細(xì)胞Ⅰ、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法Ⅱ、基因槍法（又稱微彈轟擊法）Ⅲ、花粉管通道法：（2）導(dǎo)入動物細(xì)胞方法：顯微注射技術(shù)。（3）導(dǎo)入微生物細(xì)胞第33頁/共58頁第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、轉(zhuǎn)化實質(zhì)：目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。3、受體生物不同，所用的受體細(xì)胞種類也不同。（1）植物：可以是卵細(xì)胞（受精卵）、體細(xì)胞（可經(jīng)組織培養(yǎng)成為完整個體）。（2）動物：受精卵（因為體細(xì)胞的全能性受到限制）。第34頁/共58頁第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作程序(四)第四步---目的基因的檢測與鑒定1、導(dǎo)入檢測：2、表達(dá)檢測（1）轉(zhuǎn)錄檢測:DNA分子雜交技術(shù)（2）翻譯檢測:抗原—抗體雜交（免疫）法3.鑒定：個體生物學(xué)水平鑒定原位菌落（或噬菌斑）雜交第35頁/共58頁題：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。下列是對基因工程有關(guān)檢測結(jié)果的分析，正確的是A.只要檢測到受體細(xì)胞中含有標(biāo)記基因，則表明目的基因?qū)肓耸荏w細(xì)胞B.只要檢測到受體細(xì)胞含有目的基因，則表明基因工程的任務(wù)完成了C.只要檢測到受體細(xì)胞中含有目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，則表明基因工程的目標(biāo)實現(xiàn)了D.只要檢測到受體細(xì)胞中含有所需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，則表明目的基因完成了表達(dá)過程第36頁/共58頁第三節(jié)轉(zhuǎn)座因子（transposableelement）定義：可移動位置的遺傳因子的總稱。又叫可移動因子，它是指一段特定的DNA序列，可從原來的位置上單獨(dú)復(fù)制或自動脫落下來，經(jīng)環(huán)化后再插入到染色體其他位置，并對插入位點(diǎn)附近的基因產(chǎn)生各種遺傳學(xué)效應(yīng)。第37頁/共58頁第三節(jié)轉(zhuǎn)座因子（transposableelement）發(fā)現(xiàn)歷史

BarbaraMcClintock，1902-1992）是20世紀(jì)具有傳奇般經(jīng)歷的女科學(xué)家，她在玉米中發(fā)現(xiàn)了“會跳舞”的基因。直到1967年Shapiro才在E.coli中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座因子（transposableelement）。第38頁/共58頁原核生物中的三類轉(zhuǎn)位因子：ThreeprincipleclassesofTE1.Insertionsequence（IS,插入序列）2.transposonTn（轉(zhuǎn)座子）3.轉(zhuǎn)座噬菌體存在于細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA分子上的一段可移動的遺傳元素（特異性核苷酸序列片段）細(xì)菌轉(zhuǎn)座因子的類型和結(jié)構(gòu)第39頁/共58頁插入序列（insertionsequenceIS）：最小\最簡單的轉(zhuǎn)位因子，<2kb兩端具有短的末端反向重復(fù)序列(invertedterminalrepeats)只編碼參與轉(zhuǎn)座作用的轉(zhuǎn)座酶（transposase）不攜帶任何已知與插入功能無關(guān)的基因區(qū)域插入后與插入位點(diǎn)附近的序列共同起作用。第40頁/共58頁第41頁/共58頁第42頁/共58頁轉(zhuǎn)座子（transposonTn）：一般>2kb，除攜帶與轉(zhuǎn)位有關(guān)的序列外，還帶有某些結(jié)構(gòu)基因因此當(dāng)Tn插入某一基因時，可引起細(xì)菌性狀的變化。轉(zhuǎn)座噬菌體：是一些具有轉(zhuǎn)座功能的溶原性噬菌體。

第43頁/共58頁TransposonAtransposonisaDNAsequenceabletoinsertitself(oracopyofitself)atanewlocationinthegenome,withouthavinganysequencerelationshipwiththetargetlocus.轉(zhuǎn)座(transposition)：轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移過程。第44頁/共58頁轉(zhuǎn)座子的種類與特征轉(zhuǎn)座子攜帶耐藥或毒素基因Tn1Tn2Tn3AP（氨芐青霉素）

Tn4AP、SM（鏈霉素）、Su（磺胺）

Tn5Km（卡那霉素）

Tn6Km（卡那霉素）

Tn7TMP（甲氧芐氨嘧啶）、SMTn9Cm（氯霉素）

Tn10Tc（四環(huán)素）

Tn551Em（紅霉素）

Tn971Em（紅霉素）

Tn1681大腸埃希菌（腸毒素基因）第45頁/共58頁第四節(jié)文庫構(gòu)建與酵母雙雜分析基因/蛋白互作的主要方法：（1）構(gòu)建cDNA、DNA文庫，應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的基因；（2）差式雜交(differentialscreen)和扣除雜交(subtractivehybridization)技術(shù)；（3）DD-RT-PCR法及差別顯示技術(shù)；（4）差別分析法

(Representationaldifferenceanalysis,RDA）；（5）酵母雙雜交Two-hybridsystem；（6）圖位克隆法（map-basedcloning）與染色體步移（genomicDNAWalking）。第46頁/共58頁基因組文庫的構(gòu)建

genomiclibrary：整個基因組DNA切成適當(dāng)長度的片段，連接在載體上，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中而構(gòu)建的克隆總體。應(yīng)用噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的程序：①消化，約20kb；②切割載體；③除去噬菌體裂解生長非必需的內(nèi)部片段；④連接；⑤體外包裝系統(tǒng)進(jìn)行噬菌體的組裝；⑥重組噬菌體侵染E.coli，每一克隆中含有外源DNA的一種片段，全部克隆構(gòu)成一個基因文庫。第47頁/共58頁用HacⅢ-Alul雙酶消化法采用核酸內(nèi)切限制酶Sau3A進(jìn)行局部消化第48頁/共58頁基因組文庫技術(shù)(引自Griffithsetal.1996)第49頁/共58頁cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫：以某生物的總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶成雙鏈cDNA，連接到載體上，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后構(gòu)建的基因文庫。一般比基因組文庫小10-100倍基本程序：①mRNA的提取和純化。②合成cDNA第一鏈。③將mRNA-cDNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA分子。④將雙鏈cDNA重組到噬菌體載體或質(zhì)粒載體上。⑤將重組子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒導(dǎo)入到大腸桿菌寄主細(xì)胞中增殖。第50頁/共58頁cDNA文庫構(gòu)建(引自O(shè)ld&Primrose,1980)第51頁/共58頁酵母雙雜交體系

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