種子的擴大培養(yǎng)及滅菌

種子的擴大培養(yǎng)及滅菌第1頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六

種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。種子擴大培養(yǎng)的概念:種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc第2頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：總量及濃度能滿足要求生理狀況穩(wěn)定活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長無雜菌污染種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc第3頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過程斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc第4頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六1、斜面(谷氨酸棒桿菌AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細(xì)培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc第5頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2.一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc第6頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六3.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%(10%)），32℃培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc第7頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六種子的質(zhì)量要求：108-109個/ml大小均勻，呈單個或八字排列PH7.0-7.2時結(jié)束活力旺盛種子的擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)的目的與要求/jpkc/fjgc第8頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六一、種子制備的過程1-砂土孢子；2-冷凍干燥孢子；3-斜面孢子；4-搖瓶液體培養(yǎng)；5-茄子瓶斜面培養(yǎng)；6-固體培養(yǎng)基培養(yǎng)；7、8-種子罐培養(yǎng)；9-發(fā)酵罐種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc第9頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六二、實驗室階段1、培養(yǎng)物選擇的原則目的：種子擴培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點，最終培養(yǎng)物可分為兩類：

對于不產(chǎn)孢子和芽孢的微生物——獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc第10頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子孢子培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。對于產(chǎn)孢子的微生物獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要二、實驗室階段/jpkc/fjgc第11頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長。在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要二、實驗室階段/jpkc/fjgc第12頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六三、生產(chǎn)車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體?？s短發(fā)酵時間有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果菌絲體比孢子要有利：種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc第13頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應(yīng)首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，所以營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實驗室階段那么精細(xì)，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個方面的原因:

一是成本二是馴化種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要三、生產(chǎn)車間階段/jpkc/fjgc第14頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六例：檸檬酸發(fā)酵以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc第15頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六3、發(fā)酵級數(shù)的確定谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子（搖瓶）→二級種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子（小罐）→二級種子（中罐）→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要三、生產(chǎn)車間階段/jpkc/fjgc第16頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響

級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。

在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級數(shù)的確定是非常重要的一個方面種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要三、生產(chǎn)車間階段/jpkc/fjgc第17頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六4、接種量的確定移入種子的體積接種量＝—————————接種后培養(yǎng)液的體積過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認(rèn)為大一點好。種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要三、生產(chǎn)車間階段/jpkc/fjgc第18頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六5、種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結(jié)果定。種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要三、生產(chǎn)車間階段/jpkc/fjgc第19頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六舒琴，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要/jpkc/fjgc第20頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六6、種子的質(zhì)量要求：量：要求達(dá)到一定的濃度質(zhì):形態(tài)（生長處于某個階段、均勻等等）理化指標(biāo)：C、N、P的含量，pH酶活等無污染種子的擴大培養(yǎng)種子制備的技術(shù)概要三、生產(chǎn)車間階段/jpkc/fjgc第21頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六滅菌污染雜菌的危害防止雜菌污染的措施滅菌的方法培養(yǎng)基的濕熱滅菌空氣的除菌/jpkc/fjgc第22頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六1、污染雜菌的危害使生物化學(xué)反應(yīng)的基質(zhì)或產(chǎn)物消耗，造成產(chǎn)率下降；雜菌所產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物，或染菌后發(fā)酵液的某些理化性質(zhì)的改變，使產(chǎn)物的提取變得困難，造成收得率降低或產(chǎn)品質(zhì)量下降；雜菌可能會分解產(chǎn)物；雜菌大量繁殖，會改變反應(yīng)介質(zhì)的pH，使生化反應(yīng)發(fā)生異常變化；發(fā)生噬菌體污染。/jpkc/fjgc第23頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六2、防止雜菌污染的措施設(shè)備滅菌并確保無泄漏所用培養(yǎng)基必須滅菌通入的氣體應(yīng)經(jīng)除菌處理種子無污染，確保純種培養(yǎng)過程中加入的物料應(yīng)經(jīng)滅菌處理，并在加入過程中確保無污染/jpkc/fjgc第24頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六3、滅菌的方法化學(xué)滅菌射線滅菌干熱滅菌濕熱滅菌過濾除菌滅菌：用物理或化學(xué)的方法殺滅或去除物料或設(shè)備中一切有生命物質(zhì)的過程。應(yīng)用的范圍有①培養(yǎng)基滅菌；②氣體除菌；③設(shè)備及管道滅菌等。/jpkc/fjgc第25頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六化學(xué)滅菌一些化學(xué)試劑能使微生物中的蛋白質(zhì)、酶及核酸發(fā)生反應(yīng)而具有殺菌作用。常用的化學(xué)藥劑有甲醛、氯、高錳酸鉀、環(huán)氧乙烷、季銨鹽、臭氧等?；瘜W(xué)藥劑也會與培養(yǎng)基中的一些成分作用，而且加入后不易除去，一般不用于培養(yǎng)基的滅菌。/jpkc/fjgc第26頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六射線滅菌即利用紫外線、高能電磁波或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的γ射線進行滅菌的方法。波長為（2.1-3.1）×10-7m的紫外線具有滅菌作用，最常用的波長是2.537×10-7m但紫外線穿透能力低，僅用于表面消毒和空氣的消毒。/jpkc/fjgc第27頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六干熱滅菌常用的干熱條件為在160℃下保溫1h，滅菌效果不如濕熱滅菌。一般要求保持干燥的實驗器具和材料（培養(yǎng)皿、接種針、固定化細(xì)胞用的載體材料等）可用干熱滅菌。/jpkc/fjgc第28頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六濕熱滅菌即利用飽和水蒸氣進行滅菌。蒸氣有很強的穿透力，在冷凝時放出大量冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺滅各種微生物。同時，整齊價格低廉，來源方便，滅菌效果可靠。培養(yǎng)基滅菌、發(fā)酵設(shè)備及管道滅菌、實驗用器材的滅菌，普遍采用濕熱滅菌。通常的滅菌條件是在121℃維持30min。/jpkc/fjgc第29頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六過濾除菌即利用過濾方法截留微生物，達(dá)到除菌的目的。本法只適用于澄清流體的除菌。工業(yè)上利用此法大量制備無菌空氣，供耗氧微生物的深層培養(yǎng)使用。熱敏性培養(yǎng)基也采用過濾方法來除菌。產(chǎn)品提取過程中，也可用此法處理料液，獲得無菌產(chǎn)品。/jpkc/fjgc第30頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六4、培養(yǎng)基的濕熱滅菌微生物的死亡速率濕熱滅菌時，培養(yǎng)基中的微生物受熱死亡的速率與殘存的數(shù)量成正比，即：式中，N為培養(yǎng)基中活微生物的個數(shù)；為微生物受熱時間，sK為比死亡速率，s-1/jpkc/fjgc第31頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六4、培養(yǎng)基的濕熱滅菌理論滅菌時間Ns為滅菌結(jié)束時培養(yǎng)基中活微生物數(shù)，一般取0.001個，即滅菌失敗的概率為千分之一。N0為滅菌開始時培養(yǎng)基中活微生物數(shù)，可以參考一般培養(yǎng)基中活微生物數(shù)為每毫升（1~2）x107個。/jpkc/fjgc第32頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六4、培養(yǎng)基的濕熱滅菌即將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸氣將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起滅菌的操作過程，也稱實罐滅菌。過程包括升溫、保溫（121℃，30min)和降溫三個階段，滅菌主要在保溫過程實現(xiàn)。顯著缺點是對培養(yǎng)基成分破壞大、升降溫時間長。培養(yǎng)基的分批滅菌/jpkc/fjgc第33頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六4、培養(yǎng)基的濕熱滅菌將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵罐前進行加熱、保溫、降溫的滅菌過程，也稱之為連消。連續(xù)滅菌時，培養(yǎng)基在短時間內(nèi)被加熱到滅菌溫度（130~140℃），短時間保溫后（5~8min),被快速冷卻，再進入早已滅菌完畢的發(fā)酵罐。以高溫、快速為特征，具有對培養(yǎng)基破壞小，可以實現(xiàn)自動控制、提高發(fā)酵罐的設(shè)備利用率、蒸汽用量平穩(wěn)等優(yōu)點。培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌/jpkc/fjgc第34頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六5、空氣的除菌流量：連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣，單位時間（min)單位體積（m3)培養(yǎng)基中通入標(biāo)準(zhǔn)狀況下空氣的體積（m3)一般為0.1~0.2。壓強：表壓為0.2~0.4MPa.進入過濾器前，相對濕度φ≤70%，以防止過濾介質(zhì)受潮。溫度可比培養(yǎng)溫度高10~30℃。潔凈指標(biāo)：每立方米空氣中，塵埃粒子數(shù)最大允許值≥0.5μm的為3500，≥5μm的為0，微生物最大允許數(shù)為5個浮游菌/m3,1個沉降菌/m3發(fā)酵用無菌空氣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)/jpkc/fjgc第35頁，共40頁，2023年，2月20日，星期六發(fā)酵廠所使用的空氣除菌流程，隨各地的氣候條件及設(shè)備條件不同而有很大的差別。要保持過濾器有比較高的過濾效率，應(yīng)維持一定的氣流速度和不受油、水的干擾。氣流速度可由操作來控制；要保持不受油、水干擾則要有一系列冷卻、分離、加熱的設(shè)備來保證空氣的相對濕度在50~60％的條件下過濾。/jpkc/