粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR擴(kuò)增

粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.利用RT-PCR方法擴(kuò)增出粗毛栓菌（Coriolusversicolor）木聚糖酶（Endo-beta-1,4-xylanase）cDNA片段。2.對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證和純化，得到可靠的PCR產(chǎn)物，以便后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)驗(yàn)原理：粗毛栓菌是一種可以分解木質(zhì)素的真菌，其木聚糖酶可以分解纖維素和木聚糖等木質(zhì)素類物質(zhì)，是生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和醇發(fā)酵等工業(yè)領(lǐng)域中的重要酶類。木聚糖酶通過(guò)切斷木聚糖分子內(nèi)部的β-1,4-吡喃糖基鍵（glycosidicbond），將木聚糖分子降解為低聚木糖和單體木糖，是由真菌細(xì)胞壁內(nèi)部分泌的一類酶類。對(duì)于粗毛栓菌木聚糖酶的cDNA片段擴(kuò)增，需要將細(xì)菌RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，并根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)基因片段。在PCR反應(yīng)中，引物引導(dǎo)聚合酶（TAQDNApolymerase）反向合成目標(biāo)序列的互補(bǔ)鏈，從而以引物序列為起點(diǎn)向兩端擴(kuò)增出目標(biāo)DNA片段。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證和純化，得到單一的、正確的PCR產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)步驟：1.菌株處理：將生長(zhǎng)于PDA平板上的粗毛栓菌菌落用PH7.0的10mMTris-HCl緩沖液洗滌3次，去除菌絲團(tuán)，用無(wú)菌水洗2次，將其刮下切碎保存在離心管中。2.總RNA提取：快速、徹底并規(guī)范的RNA提取至關(guān)重要。使用RNA純化試劑盒，將菌落加入離心管中，進(jìn)行裂解。離心汁液，取得液體層懸液，加入等體積的異丙醇，振動(dòng)后沉淀RNA。去除酚/氯仿和異丙醇，備用。3.cDNA合成：使用PrimeScriptRTReagentKit逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA。反應(yīng)管：菌落裂解液RNA1μg、隨機(jī)六聚核苷酸2.5μl、OligodTPrimer2.5μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、5倍RT甲基化酶緩沖液4μl、RNasefreeddH2O9μl。RT反應(yīng)條件：50℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5s，4℃靜置，反應(yīng)混合物即cDNA模板。4.引物設(shè)計(jì)：根據(jù)粗毛栓菌木聚糖酶的cDNA序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，長(zhǎng)度為23bp。引物序列：前引物（Forwardprimer）：5’-AGTCAGCATGCATGAATGCTGTG-3’后引物（Reverseprimer）：5’-CCTGGGCGATCCGGATCTTTTTTC-3’5.PCR擴(kuò)增：以cDNA為模板、引物為核心，使用TAQDNApolymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：引物各0.5μl、dNTP20μM2μl、5×PCRBuffer10μl（MgCl2）調(diào)整MgCl2個(gè)別引物濃度，TAQEnzyme0.5μl、模板cDNA2μl、RNasefreeddH2O35μl。PCR反應(yīng)體系總量為50μl。PCR反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)5min，95℃反應(yīng)30s，63℃反應(yīng)30s，72℃反應(yīng)30s，30個(gè)循環(huán)，72℃反應(yīng)10min，4℃靜置。6.驗(yàn)證：將PCR產(chǎn)物取三份，進(jìn)行一定的比例稀釋后進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)中需設(shè)置空白對(duì)照和正對(duì)照?？瞻讓?duì)照區(qū)域加RNasefreeddH2O，正對(duì)照區(qū)域加入已知的大腸桿菌cDNA作為模板。在200V恒流下，電泳時(shí)間50min，取照片。7.分離：將PCR產(chǎn)物提取至2%瓊脂糖，利用PCR清擇試劑盒進(jìn)行純化，取上清液測(cè)量質(zhì)量和純度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)成功得到粗毛栓菌木聚糖酶的cDNA片段。2.PC電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出明亮的610bp片段，與預(yù)期的目標(biāo)片段大致相符，表明PCR擴(kuò)增成功。3.經(jīng)過(guò)PCR清擇試劑盒純化后，PCR產(chǎn)物純度和質(zhì)量良好，可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模板使用。實(shí)驗(yàn)總結(jié)：本實(shí)驗(yàn)成功利用RT-PCR方法擴(kuò)增出粗毛栓菌木聚糖酶cDNA片段，并通過(guò)電泳和純化等方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了驗(yàn)