第六章 魏培海儀器分析色譜分析法

色譜法或色譜分析法，是一種分離分析技術，它利用混合物中各物質在兩相間分配系數(shù)的差別，當溶質在兩相間作相對移動時，各物質在兩相間進行多次分配，從而使各組分得到分離?？赏瓿蛇@種分離的儀器稱為色譜儀。現(xiàn)在是1頁\一共有72頁\編輯于星期二本章教學內(nèi)容色譜分離儀的基本原理和基本概念色譜分離的理論基礎色譜定性和定量分析的方法現(xiàn)在是2頁\一共有72頁\編輯于星期二本章知識目標熟悉色譜分析中的基本術語;了解色譜分析中的塔板理論和速率理論;熟悉影響色譜柱柱效、分離度的因素;熟悉色譜分析中的定性和定量方法。現(xiàn)在是3頁\一共有72頁\編輯于星期二本章能力目標熟練校正因子的計算方法;掌握歸一化法、內(nèi)標法的定量計算方法;掌握外標法，熟練繪制外標法工作曲線并進行定量計算;掌握填充柱的制備方法?，F(xiàn)在是4頁\一共有72頁\編輯于星期二第一節(jié)色譜及分類

現(xiàn)在是5頁\一共有72頁\編輯于星期二茨維特實驗固定相——CaCO3顆粒流動相——石油醚

色帶現(xiàn)在是6頁\一共有72頁\編輯于星期二一、色譜法色譜法是一種分離分析技術。它是利用各物質在兩相中具有不同的分配系數(shù)，當兩相作相對運動時，這些物質在兩相中進行多次反復的分配來達到分離的目的

。色譜法以其具有高分離效能、高檢測性能、分析時間快速而成為現(xiàn)代儀器分析方法中應用最廣泛的一種方法?，F(xiàn)在是7頁\一共有72頁\編輯于星期二

固定相——在色譜柱中固定不動的相?？梢允枪腆w，還可以是液體。

流動相——攜帶試樣混合物流過固定相的流體，是液體或氣體。

色譜柱——承載固定相的裝置。各種材質和尺寸。

被分離組分——不再僅局限于有色物質基本術語：現(xiàn)在是8頁\一共有72頁\編輯于星期二二、色譜法分類

1．按兩相分子的聚集狀態(tài)流動相

固定相類型液相色譜液體

固體

液-固色譜液體

液體

液-液色譜氣體

固體

氣-固色譜氣體

液體

氣-液色譜氣相色譜現(xiàn)在是9頁\一共有72頁\編輯于星期二2．按固定相的固定方式平面色譜

紙色譜薄層色譜高分子薄膜色譜柱色譜

填充柱色譜毛細管柱色譜

現(xiàn)在是10頁\一共有72頁\編輯于星期二3．按分離機制分分配色譜：利用分配系數(shù)的不同吸附色譜：利用物理吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換原理空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同現(xiàn)在是11頁\一共有72頁\編輯于星期二

色譜法的特點分離效率高：復雜混合物，有機同系物、異構體。手性異構體。靈敏度高：可以檢測出μg.g-1(10-6)-ng.g-1(10-9)級的物質量。分析速度快：一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。應用范圍廣：氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。不足之處：被分離組分的定性較為困難?，F(xiàn)在是12頁\一共有72頁\編輯于星期二分離過程

當流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質和結構上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出?，F(xiàn)在是13頁\一共有72頁\編輯于星期二第二節(jié)色譜流出曲線和術語

現(xiàn)在是14頁\一共有72頁\編輯于星期二一、色譜流出線

從進樣到被測組分流出色譜柱進入檢測器連續(xù)測定，得到的檢測信號隨時間變化的曲線稱為色譜流出曲線或色譜圖。現(xiàn)在是15頁\一共有72頁\編輯于星期二二、色譜術語

1．基線：操作條件穩(wěn)定后，無樣品通過時檢測器所反映的信號一時間曲線。

它反映檢測器系統(tǒng)噪聲隨時間變化。穩(wěn)定的基線是一條直線?，F(xiàn)在是16頁\一共有72頁\編輯于星期二2．色譜峰：從被測組分開始進入檢測器至完全流出檢測器所形成的峰型部分稱色譜峰?；€與色譜峰組成了一個完整的色譜圖。色譜峰現(xiàn)在是17頁\一共有72頁\編輯于星期二3．保留值

保留時間tM：不與固定相作用的物質從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間。保留時間tR：試樣從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間。它包括組份隨流動相通過柱子的時間tM和組份在固定相中滯留的時間。調整保留時間：某組份的保留時間扣除死時間后的保留時間，它是組份在固定相中的滯留時間?，F(xiàn)在是18頁\一共有72頁\編輯于星期二死體積Vm：不被保留的組分通過色譜柱所消耗的流動相的體積，又指色譜柱中未被固定相所占據(jù)的空隙體積（包括色譜儀中的管路、連接頭的空間、檢測器的空間）。F0：流動相的體積流速現(xiàn)在是19頁\一共有72頁\編輯于星期二保留體積VR：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所消耗的流動相的體積。調整保留體積：保留體積與死體積之差，即組分停留在固定相時所消耗流動相的體積現(xiàn)在是20頁\一共有72頁\編輯于星期二

相對保留值is

：一定實驗條件下組分i與另一標準組分S的調整保留時間之比。相對保留值只與柱溫和固定相性質有關，與其他色譜操作條件無關，色譜定性分析的重要參數(shù)

?，F(xiàn)在是21頁\一共有72頁\編輯于星期二4.色譜峰區(qū)域分析峰高h：色譜峰頂?shù)交€的垂直距離?，F(xiàn)在是22頁\一共有72頁\編輯于星期二半峰寬W1/2：色譜峰高一半處的寬度。峰底寬W：從色譜峰兩側拐點上的切線與基線交點之間的距離，也稱基線寬度。標準偏差：峰高(h)的0.607倍處色譜峰寬度的一半。與半峰寬及峰底寬的關系為：W1/2=2.354W=4

區(qū)域寬度：現(xiàn)在是23頁\一共有72頁\編輯于星期二峰面積（A）：由色譜峰與基線之間所圍成的面積稱為峰面積。定量分析的基本依據(jù)。對理想的對稱峰：A=1.065hW1/2

現(xiàn)在是24頁\一共有72頁\編輯于星期二在相同的色譜操作條件下獲得的色譜峰的區(qū)域寬度值越小，說明色譜柱的分離效能越好，柱效越高。現(xiàn)在是25頁\一共有72頁\編輯于星期二5.描述分配過程的參數(shù)分配系數(shù)K：組分在固定相和流動相之間的分配處于平衡狀態(tài)時，在兩相中的濃度之比。K

只與固定相和溫度有關，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關?，F(xiàn)在是26頁\一共有72頁\編輯于星期二

分配比k：：

在一定的溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比。

=Vm/Vs，表示相比率，是柱型特點參數(shù)，對于填充柱，值一般為6~35，對于毛細管柱，值一般為60~600。現(xiàn)在是27頁\一共有72頁\編輯于星期二選擇性因子：

指相鄰兩組分調整保留值之比。值的大小反映了色譜柱對難分離組分對的分離選擇性，值越大，相鄰兩組分色譜峰相距越遠，色譜柱的分離選擇性越高。當?shù)扔诨蚪咏?時，說明相鄰兩組分不能分離?，F(xiàn)在是28頁\一共有72頁\編輯于星期二色譜流出曲線的意義色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個數(shù)；色譜保留值——定性依據(jù)；色譜峰高或面積——定量依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域寬度——色譜柱分離效能評價指標；色譜峰間距——固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)?，F(xiàn)在是29頁\一共有72頁\編輯于星期二第三節(jié)色譜分析基本理論兩組份峰間距足夠遠：由各組份在兩相間的分配系數(shù)決定，即由色譜過程的熱力學性質決定。每個組分峰寬足夠?。河山M份在色譜柱中的傳質和擴散決定，即由色譜過程的動力學性質決定。現(xiàn)在是30頁\一共有72頁\編輯于星期二熱力學理論：塔板理論——平衡理論動力學理論：速率理論——Vander方程基本理論現(xiàn)在是31頁\一共有72頁\編輯于星期二一、塔板理論

塔板模型：將一根色譜柱視為一個精餾塔，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度?，F(xiàn)在是32頁\一共有72頁\編輯于星期二塔板理論假設：在每一塊塔板上，溶質在兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前轉移。對一根長為L的色譜柱，溶質平衡的次數(shù)n稱為理論塔板數(shù)?，F(xiàn)在是33頁\一共有72頁\編輯于星期二塔板理論要點當溶質在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n大于50時，可得到基本對稱的峰形曲線。當試樣進入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復多次的分配平衡后，仍可獲得良好的分離。n與半峰寬度及峰底寬的關系式為：

現(xiàn)在是34頁\一共有72頁\編輯于星期二有效塔板數(shù)和有效塔板高度單位柱長的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質計算可得到不同的理論塔板數(shù)。常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效：

現(xiàn)在是35頁\一共有72頁\編輯于星期二

例題1：在柱長為2m的5%的阿皮松柱、柱溫為1000C，記錄紙速度為2.0cm/min的色譜條件下，測定苯的保留時間為1.5min，半峰寬為0.20cm，求理論塔板數(shù)。解(1)：現(xiàn)在是36頁\一共有72頁\編輯于星期二解(2)：現(xiàn)在是37頁\一共有72頁\編輯于星期二二、速率理論

速率方程（也稱范.弟姆特方程式）

u為流動相線速度；A，B，C為常數(shù)A—分別表示渦流擴散系數(shù)；B—分子擴散系數(shù)；C—傳質阻力系數(shù)（包括液相和固相傳質阻力系數(shù)）減小A、B、C三項可提高柱效現(xiàn)在是38頁\一共有72頁\編輯于星期二1．渦流擴散項

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子現(xiàn)在是39頁\一共有72頁\編輯于星期二固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄?，F(xiàn)在是40頁\一共有72頁\編輯于星期二2．分子縱向擴散項

B=2νDgν

：彎曲因子，填充柱色譜，ν<1。Dg：組分分子在氣相中的擴散系數(shù)（cm2·s-1）現(xiàn)在是41頁\一共有72頁\編輯于星期二擴散導致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差液相色譜中的分子縱向擴散可以忽略。對氣相色譜，采用相對分子質量較大的N2、Ar為流動相并適當加大流動相流速，可降低分子縱向擴散項的影響.現(xiàn)在是42頁\一共有72頁\編輯于星期二3．傳質阻力項

k為容量因子；Dg、Ds為擴散系數(shù)。現(xiàn)在是43頁\一共有72頁\編輯于星期二固定相液膜越薄，擴散系數(shù)越大，固定相傳質阻力就越小，但固定相液膜不宜過薄，否則會減少樣品容量，降低柱的壽命。減小擔體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質阻力。現(xiàn)在是44頁\一共有72頁\編輯于星期二三、分離度

1．色譜柱的總分離效能

(a)兩色譜峰距離近且峰形寬，彼此嚴重相重疊，柱效和選擇性都差；(b)雖能很好分離，但峰形很寬，表明選擇性好，但柱效低；(c)分離情況最為理想，既有良好的選擇性，又有高的柱效。

現(xiàn)在是45頁\一共有72頁\編輯于星期二2.分離度(R)的表達式R值越大，表明兩組分的分離程度越高;R=1.0時，分離程度可達98％;R<1.0時兩峰有部分重疊;R=1.5時，分離程度達到99.7％;所以，通常用R=1.5作為相鄰兩色譜峰完全分離的指標。

現(xiàn)在是46頁\一共有72頁\編輯于星期二R=1.5R=0.75R=1.0響應信號保留時間t,min現(xiàn)在是47頁\一共有72頁\編輯于星期二3.色譜分離方程分離度R與塔板數(shù)有關;分離度R與保留因子

有關系；越大，柱選擇性越好，對分離有利。現(xiàn)在是48頁\一共有72頁\編輯于星期二例2：兩物質A和B在30cm長的色譜柱上的保留時間分別為16.4和17.63min，有一不與固定相作用的物質，其在此柱上的保留時間為1.30min。物質A和B的峰底寬分別為1.11和1.21min。試問：1）柱分離度R；2）柱平均理論塔板數(shù)nav3）平均塔板高度Hav4）若要求R達到1.5，則柱長至少應為多少？現(xiàn)在是49頁\一共有72頁\編輯于星期二現(xiàn)在是50頁\一共有72頁\編輯于星期二4)完全分離,R=1.5現(xiàn)在是51頁\一共有72頁\編輯于星期二【例3】有一根1.5m長的柱子，分離組分1和2，得到如圖6-5所示的色譜圖。圖中橫坐標為記錄紙走紙距離。(1)求此兩種組分在該色譜柱上的分離度和該色譜柱的有效塔板數(shù)。(2)如要使1、2完全分離，色譜柱應該要加到多長？現(xiàn)在是52頁\一共有72頁\編輯于星期二求出分離度：

有效塔板數(shù)：

【解】（1）先求出組分2對組分1的相對保留值2,1(即值)現(xiàn)在是53頁\一共有72頁\編輯于星期二（2）該柱有效塔板高度：完全分離的條件是分離度R=1.5此時色譜柱的有效塔板數(shù)：要使有效塔板數(shù)為4356塊，柱長現(xiàn)在是54頁\一共有72頁\編輯于星期二第四節(jié)定性和定量分析

色譜法是分離復雜混合物的重要方法,同時還能將分離后的物質直接進行定性和定量分析。

現(xiàn)在是55頁\一共有72頁\編輯于星期二一、定性分析色譜定性分析:確定色譜圖上每一個峰所代表的物質。依據(jù):在色譜條件一定時，任何一種物質都有確定的保留時間。方法:在相同色譜條件下，通過比較已知物和未知物的保留值或在固定相上的位置，即可確定未知物是何種物質。方法的發(fā)展:色譜與質譜或其它光譜法聯(lián)用，是目前解決復雜混合物中未知物定性分析的最有效的技術?，F(xiàn)在是56頁\一共有72頁\編輯于星期二二、定量分析

色譜定量分析:在一定的色譜條件下，組分i的質量(mi)或其在流動相中的濃度，依據(jù):組分i的質量(mi)或其在流動相中的濃度，與檢測器響應信號(峰面積Ai或峰高hi)呈正比。分別為峰面積和峰高的校正因子。

現(xiàn)在是57頁\一共有72頁\編輯于星期二1．響應信號的測量

峰高：峰頂與基線之間的距離，測量比較簡單，特別適于較窄的色譜峰峰面積：（1）自動測量：色譜工作站。（2）手工法測量：現(xiàn)在是58頁\一共有72頁\編輯于星期二手工測量對稱的峰:近似計算公式為：A=1.064h·W1/2不對稱峰:近似計算公式為:

A=h·（W

0.15+W

0.85）/2W0.15和W0.85分別是峰高0.15和0.85處的峰寬值

現(xiàn)在是59頁\一共有72頁\編輯于星期二2．定量校正因子

(1)絕對校正因子:組分i的峰面積和峰高的絕對校正因子分別為：絕對校正因子是指某組分i通過檢測器的量與檢測器對該組分的響應信號之比。mi的單位用克、摩爾或體積表示時相應的校正因子，分別稱為質量校正因子(fm)，摩爾校正因子(fM)和體積校正因子(fv)

現(xiàn)在是60頁\一共有72頁\編輯于星期二(2)相對校正因子

相對校正因子：指組分i與基準組分s的絕對校正因子之比.

由于絕對校正因子很少使用，因此，一般文獻上提到的校正因子，就是相對校正因子。

現(xiàn)在是61頁\一共有72頁\編輯于星期二表6-1一些化合物的相對校正因子化合物沸點/C相對分子質量熱導池檢測器氫焰檢測器fMfvfm甲烷-160162.800.451.03乙烷-89301.960.591.03丙烷-42441.550.681.02丁烷-0.5581.180.680.91乙烯-104282.080.590.98丙烯-48421.550.63現(xiàn)在是62頁\一共有72頁\編輯于星期二3.定量方法

分類：（1）外標法（2）內(nèi)標法（3）歸一化法現(xiàn)在是63頁\一共有72頁\編輯于星期二（1）外標法把待測組分的純物質配成不同濃度的標準系列；在一定操作條件下分別向色譜柱中注入相同體積的標準樣品，測得各峰的峰面積或峰高，繪制A—c或h-c的標準曲線；在完全相同的條件下注入相同體積的待測樣品，根據(jù)所得的峰面積或峰高從曲線上查得含量。外標法也稱為標準曲線法現(xiàn)在是64頁\一共有72頁\編輯于星期二現(xiàn)在是65頁\一共有7